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MMD 1045 examen 1 > diagnostic moléculaire > Flashcards

diagnostic moléculaire Flashcards

1
Q

qu’est ce qu’un diagnostic moléculair ?

A

diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigénome

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Q

donner structure acide nucléique

A

sucre+phosphate+base

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3
Q

charge ADN

A

négative

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4
Q

nombre de LH pour GC

A

3

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5
Q

nombre de LH pour AT

A

2

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6
Q

en amont du côté 5’ nous avons…

A

promoteur

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7
Q

qu’est ce qu’une varibialité non pathologique?

A

toute divergence de séquence ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associé à une pathologie génétique

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8
Q

qu’est ce qu’une variabilité pathologique?

A

changement permanent et transmissible de la séquence ADN causant un phénotype pathologique

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9
Q

une varibialité non pathologique peut-être utile pour..

A

greffes par exemple!

voir si le patient va rejeter ou non

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10
Q

nombre de variations entre le génome d’un individu et celui de référence

A

5 à 6 millions

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11
Q

de ces 5 à 6 millions, combien arrive de novo? (absent chez les parents)

A

70

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12
Q

est-ce que toutes les 5 à 6 millions ont un impact sur phénotype?

A

NON

  • surviennnet dans régions non codantes (intergéniques, introns) sans affecter expression du gène
  • polymorphismes fréquents
  • touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
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13
Q

causes externes de variations génétiques

A

radiations
uv
cliniques (agents alkylants; chimie)

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14
Q

causes internes variations génétiques

A
  • dépurination
  • déamination
  • radicaux libres
  • erreurs polymérise
  • erreurs réplications et recombinaison
  • méthylation
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15
Q

causes internes variations génétiques

A
  • dépurination
  • déamination
  • radicaux libres
  • erreurs polymérise
  • erreurs réplications et recombinaison
  • méthylation
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16
Q

quel endroit est fréquent pour des mutations?

A 
dinucléotides CG (ilots CpG)
-C devient méthyle
-mehtyl C devient U
-U code pour T 
(20 fois plus fréquent que les autres mutations)
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17
Q

variations non pathologique selon taille; GRANDE

A

CNV, LINE

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18
Q

variations non pathologique selon taille; MOYENNE

A

microsatellites

*séquences répétées (souvent cacacacaca)

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19
Q

variations non pathologique selon taille;PETITES

A

SNP (arrive à tous les 100 nucléotides/single nucleotides polymorphismes ) , indels (délétions)

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20
Q

les petits réarrangement peuvent être de types… (3)

A
  • substitution (transition et transversion)
  • insertion (mutations dynamiques=triplets)
  • délétion
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21
Q

les grands réarrangements peuvent être de type … (3)

A
  • insertions
  • délétions
  • équilibrés
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22
Q

mode de mutation le plus fréquent

A

**substition

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23
Q

conséquence variation homologue

A

change un codon pour un autre codant pour le même aa

=silencieux

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24
Q

conséquence variation faux sens (missense)

A

change codon pour un autre codant pour un autre aa

*plus difficile; peut causer une maladie ou non

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25
Q

quelle est exception d’une variation homologue, la rendant non silencieuse

A

si interfère avec le site consensus= interfère avec l’épissage

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26
Q

conséquence variation de l’altération du cadre de lecture (frameshift)

A

insertion ou délétion qui n’est pas un multiple de 3

=modification du codon et de ceux en aval (souvent introduction d’un codon STOP prématuré)

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27
Q

conséquence variation non sens

A

change le codon pour un codon stop

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28
Q

est ce qu’une variation non sens pourrait ne pas avoir d’impact?

A

oui dans les grosses protéines mais normalement, sont pathogénique

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29
Q

variation faux sens est pathologique ou non?

A

variable

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30
Q

variations non sens et frameshift; pathologique ou non?

A

habituellement pathologique

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31
Q

quels sont les éléments à considérer pour savoir si une variation est pathologique ou non?

A
  • fréquence population
  • conservation
  • impact ARNm
  • impact protéine
  • fonction gène
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32
Q

variation homologue; pahtologique ou non?

A

normalement non

33
Q

type de gène uniquement exprimé à état homozygote

A

récessif

34
Q

type de gène exprimé à état hétérozygote

A

dominant

35
Q

qu’est ce qu’une perte de fonction?

A

réduction dans la quantité de protéine produite ou réduction de l’activité de la protéine
=entraine le phénotype

36
Q

qu’est ce qu’un gain de fonction?

A

augmentation dans la quantité de la protéine produite, augmentation de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraine le phénotype

37
Q

quels mécanismes sont associés à des gains de fonctions?

A
  • augmentation du dosage génique
  • altération de l’expression ARNm
  • activité accrue de la protéine
  • nouvelle fonction protéine
  • altérations toxiques à la protéine
38
Q

un individu avec un X fragile pourrait avoir un enfant sain?

A

OUI
mais dépend de son génotype
-si normal; ok
-si prémutation; son enfant pourrait avoir la maladie

39
Q

quelles maladies ont des expansions TRÈS grandes?

A

Steiner, x fragile, fredreich

*mutation dans une portion non codante du gène (UTR, introns)

40
Q

quelles maladies ont des expansions petites?

A

Huntington, SCA1, DMOP

*mutation dans portion codante (exon)

41
Q

but de l’isolation de ADN

A

isoler ADN du reste du contenu cellulaire (on retrouve beaucoup de protéines…)
**on se sert des caractéristiques spécifiques de ADN par rapport au reste du contenu cellulaire

42
Q

décire la technique sels chaotropiques pour isoler ADN

A
  • ADN se fixe à la colonne de verre/membrane

- le reste (protéines, lipides, HC charge neutre= sont solubles dans l’eau)

43
Q

comment évaluer l’efficacité de l’isolation par densité optique?

A

on estime la quantité de ADN par le ratio 260 (absorbance max ADN)/280 (absorbance max protéines)
**estime pureté

44
Q

comment évaluer l’efficacité de l’isolation de ADN par teintures intercalantes?

A
  • SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium
  • composés qui se fixent à AND double brin
  • estimation de la quantité et de la taille de ADN
45
Q

comment isoler l’ADN avec la technique de phénol-chlorophrome?

A

aa sont chargés négativement et sont donc hydrosolublesalors que le reste (protéines, lipides, HC charge neutre) ont une phase organique
=ADN se positionne entre le phénol et le chloroforme

46
Q

pourquoi on ne préfère pas utiliser la technique phénol chlorophrome?

A

toxique et peu automatisable

47
Q

qu’est ce que le principe d’hybridation?

A

construire une séquence de nucléotides complémentaires à une portion ADN du patient (sonde)
=marque (fluroescence, radioactivité)
=détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire

48
Q

qu’est ce que le principe de l’électrophorèse capillaire?

A

séparer les molécules ADN selon leur taille ne les faisant migrer à travers un gel d’agarose
(migre moins loins si gros)

49
Q

qu’est ce que la technique Buvardage Southern?

A

technique qui combine électrophorèse sur gel de ADN génomique fragmenté à l’hybridation par une sonde marquée complémentaire à ADN cible

50
Q

donner les étapes du Buvardage Southern

A 
1-digestion ADN génomique
2-électrophorèse
3-transfert sur membrane
4-hybridation 
5-détection par autoradiographie
51
Q

à quoi sert la technique Buvardage Southern?

A

permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)

52
Q

composantes pour PCR

A
  • ADN patient
  • amorces; oligonuclétodies permettant a la réaction de commencer
  • polymérase
  • nucléotides
  • tampon (ions, mg)
  • autres additifs si nécessaires
53
Q

meilleure ADN polymérase?

A

Taq

**toutes les polymérases peuvent faire des erreurs

54
Q

comment ce déroule un cycle de PCR?

A 
dénaturer
hybrider (refroidie)
dénaturer (réchauffe) 
**passe de simple brin à double brin 
=on double quantité ADN à chaque cycle
55
Q

comment trouver le nombre de molécules ADN produites par PCR?

A

2^n

*n=nombre de cycles de pcr

56
Q

but du PCR migration

A

permet de détecter les insertions ou les délétions
*électrophorèse capillaire des produits PCR
=détection du signal; la distance ou se situe la bande par rapport au puit réflète sa taille

57
Q

applications du PCR-migration

A

analyses d’identités génétique; instabilités des micro satellites, contaminations foeto-maternelle, judiciaire
*insertions et délétions récurrentes

58
Q

principe du PCR-digesiton

A

digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnait une séquence spécifique
*mutation crée ou abolit site de restriction

59
Q

EcoR1 coupe à …

A

G_AATTC

60
Q

DraI coupe à ..

A

TTT_AAA

61
Q

applications du PCR digestion

A

mutations ponctuelles récurrentes

*on trouve un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche

62
Q

est-ce qu’un mismatch en 3’permet une extension?

ASPE

A

non!

extension seulement si match en 3’

63
Q

nom de la technique incluant un appareil d’électrophorèse très complexe permettant une précision de 1 nucléotide?

A

séquencage de Sanger

64
Q

dans le séquençage de Sanger, comment la chaine se termine?

A

ddNTP ne contient pas de OH au segment C3 du ribose!

empêche de se lier au prochain dNTP

65
Q

quelle est la caractréstique d’un PCR en temps réel?

A

réaction PCR et détection du produit en continue!

*discrimination allélique est quantification (relative/absolue)

66
Q

comment fonction la sonde TaqMan?

A
  • sonde possède un rapporteur et un quencheur
  • sonde se lie à ADN et à l’amorce
  • Taq libère rapporteur= fluorescence
67
Q

selon la méthode de PCR en temps réel, un échantillon prend 24 cycles pour atteindre le seuil (RFU) et le deuxième prend 24 cycles. quel échantillon avait le plus ADN?

A

le premier!

le deuxième avait 2 fois moins ADN au départ

68
Q

donner les étapes de la technique de PCR MLPA

A
  • dénaturation
  • hybridation des 2 portions de la sonde (1 nucléotide de distance)
  • ligation des 2 portions de la sonde par ligase
  • amplification PCR de la sonde fusionnée
  • électrophorèse capillaire
69
Q

avantages d’un séquençage de nouvelles générations?

A

-multiplier infos obtenus par analyse
-possible d’analyser plusieurs gènes, voir plusieurs patients en même temps (codes barres moléculaires!!)
(on compartimente le séquençage)

70
Q

quelle est la manière la plus simple de pouvoir faire une fragmentation de ADN?

A

sonication

possible par nébulisation et digestion

71
Q

nommer les 2 techniques d’amplification en parallèle

A

PCR-émulsion
PCR-cluster
(permet de faire plusieurs réaction de PCR en même temps de différents ou de même patients)

72
Q

que ce passe t-il à l’étape d’analyse bioinformatique 1?

A

génération de plusieurs milliers de séquences d’environ 100 à 150 pb
=les séquences peuvent être attribuées à chaque patient selon un code barre moléculaire

73
Q

que ce passe t-il à l’étape d’analyse bioinformatique 2?

A
  • alignement des séquences au bon endroit du génome humain
  • voir si varation
  • estce que ces variations sont pathologiques
  • est-ce que présent sur gènes variations présentes sur gènes pouvant expliquer le phénotype de patient
74
Q

combien avons de MB et de nucléotides dans exome?

A

30 MB et 30 nucléotides (soit 20 000 variants)

75
Q

est-ce que dans ADN foetal analysé la variation est présente également chez la mère?

A

NON

76
Q

la technique de PCR migration est bonne à utiliser pour trouver…

A

insertion/del

77
Q

la technique PCR digestion est bonne à utiliser pour trouver…

A

mutations ponctuelles récurrentes

78
Q

le séquencage Sanger est est bonne à utiliser pour trouver…

A

grande nbre mutation dans 1 gène
substition
petites insertion/del
detecte pas de grande anomalie

79
Q

la technique MLPA

A

deletion ou duplication

MMD 1045 examen 1 (9 decks)

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