diagnostic moléculaire Flashcards
1
Q
qu’est ce qu’un diagnostic moléculair ?
A
diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigénome
2
Q
donner structure acide nucléique
A
sucre+phosphate+base
3
Q
charge ADN
A
négative
4
Q
nombre de LH pour GC
A
3
5
Q
nombre de LH pour AT
A
2
6
Q
en amont du côté 5’ nous avons…
A
promoteur
7
Q
qu’est ce qu’une varibialité non pathologique?
A
toute divergence de séquence ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associé à une pathologie génétique
8
Q
qu’est ce qu’une variabilité pathologique?
A
changement permanent et transmissible de la séquence ADN causant un phénotype pathologique
9
Q
une varibialité non pathologique peut-être utile pour..
A
greffes par exemple!
voir si le patient va rejeter ou non
10
Q
nombre de variations entre le génome d’un individu et celui de référence
A
5 à 6 millions
11
Q
de ces 5 à 6 millions, combien arrive de novo? (absent chez les parents)
A
70
12
Q
est-ce que toutes les 5 à 6 millions ont un impact sur phénotype?
A
NON
- surviennnet dans régions non codantes (intergéniques, introns) sans affecter expression du gène
- polymorphismes fréquents
- touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
13
Q
causes externes de variations génétiques
A
radiations
uv
cliniques (agents alkylants; chimie)
14
Q
causes internes variations génétiques
A
- dépurination
- déamination
- radicaux libres
- erreurs polymérise
- erreurs réplications et recombinaison
- méthylation
15
Q
causes internes variations génétiques
A
- dépurination
- déamination
- radicaux libres
- erreurs polymérise
- erreurs réplications et recombinaison
- méthylation
16
Q
quel endroit est fréquent pour des mutations?
A
dinucléotides CG (ilots CpG) -C devient méthyle -mehtyl C devient U -U code pour T (20 fois plus fréquent que les autres mutations)
17
Q
variations non pathologique selon taille; GRANDE
A
CNV, LINE
18
Q
variations non pathologique selon taille; MOYENNE
A
microsatellites
*séquences répétées (souvent cacacacaca)
19
Q
variations non pathologique selon taille;PETITES
A
SNP (arrive à tous les 100 nucléotides/single nucleotides polymorphismes ) , indels (délétions)
20
Q
les petits réarrangement peuvent être de types… (3)
A
- substitution (transition et transversion)
- insertion (mutations dynamiques=triplets)
- délétion
21
Q
les grands réarrangements peuvent être de type … (3)
A
- insertions
- délétions
- équilibrés
22
Q
mode de mutation le plus fréquent
A
**substition
23
Q
conséquence variation homologue
A
change un codon pour un autre codant pour le même aa
=silencieux
24
Q
conséquence variation faux sens (missense)
A
change codon pour un autre codant pour un autre aa
*plus difficile; peut causer une maladie ou non
25
quelle est exception d'une variation homologue, la rendant non silencieuse
si interfère avec le site consensus= interfère avec l'épissage
26
conséquence variation de l'altération du cadre de lecture (frameshift)
insertion ou délétion qui n'est pas un multiple de 3
| =modification du codon et de ceux en aval (souvent introduction d'un codon STOP prématuré)
27
conséquence variation non sens
change le codon pour un codon stop
28
est ce qu'une variation non sens pourrait ne pas avoir d'impact?
oui dans les grosses protéines mais normalement, sont pathogénique
29
variation faux sens est pathologique ou non?
variable
30
variations non sens et frameshift; pathologique ou non?
habituellement pathologique
31
quels sont les éléments à considérer pour savoir si une variation est pathologique ou non?
- fréquence population
- conservation
- impact ARNm
- impact protéine
- fonction gène
32
variation homologue; pahtologique ou non?
normalement non
33
type de gène uniquement exprimé à état homozygote
récessif
34
type de gène exprimé à état hétérozygote
dominant
35
qu'est ce qu'une perte de fonction?
réduction dans la quantité de protéine produite ou réduction de l'activité de la protéine
=entraine le phénotype
36
qu'est ce qu'un gain de fonction?
augmentation dans la quantité de la protéine produite, augmentation de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraine le phénotype
37
quels mécanismes sont associés à des gains de fonctions?
- augmentation du dosage génique
- altération de l'expression ARNm
- activité accrue de la protéine
- nouvelle fonction protéine
- altérations toxiques à la protéine
38
un individu avec un X fragile pourrait avoir un enfant sain?
OUI
mais dépend de son génotype
-si normal; ok
-si prémutation; son enfant pourrait avoir la maladie
39
quelles maladies ont des expansions TRÈS grandes?
Steiner, x fragile, fredreich
| *mutation dans une portion non codante du gène (UTR, introns)
40
quelles maladies ont des expansions petites?
Huntington, SCA1, DMOP
| *mutation dans portion codante (exon)
41
but de l'isolation de ADN
isoler ADN du reste du contenu cellulaire (on retrouve beaucoup de protéines...)
**on se sert des caractéristiques spécifiques de ADN par rapport au reste du contenu cellulaire
42
décire la technique sels chaotropiques pour isoler ADN
- ADN se fixe à la colonne de verre/membrane
| - le reste (protéines, lipides, HC charge neutre= sont solubles dans l'eau)
43
comment évaluer l'efficacité de l'isolation par densité optique?
on estime la quantité de ADN par le ratio 260 (absorbance max ADN)/280 (absorbance max protéines)
**estime pureté
44
comment évaluer l'efficacité de l'isolation de ADN par teintures intercalantes?
* SYBR Green, Pico Green, bromure d'éthidium
- composés qui se fixent à AND double brin
- estimation de la quantité et de la taille de ADN
45
comment isoler l'ADN avec la technique de phénol-chlorophrome?
aa sont chargés négativement et sont donc hydrosolublesalors que le reste (protéines, lipides, HC charge neutre) ont une phase organique
=ADN se positionne entre le phénol et le chloroforme
46
pourquoi on ne préfère pas utiliser la technique phénol chlorophrome?
toxique et peu automatisable
47
qu'est ce que le principe d'hybridation?
construire une séquence de nucléotides complémentaires à une portion ADN du patient (sonde)
=marque (fluroescence, radioactivité)
=détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
48
qu'est ce que le principe de l'électrophorèse capillaire?
séparer les molécules ADN selon leur taille ne les faisant migrer à travers un gel d'agarose
(migre moins loins si gros)
49
qu'est ce que la technique Buvardage Southern?
technique qui combine électrophorèse sur gel de ADN génomique fragmenté à l'hybridation par une sonde marquée complémentaire à ADN cible
50
donner les étapes du Buvardage Southern
```
1-digestion ADN génomique
2-électrophorèse
3-transfert sur membrane
4-hybridation
5-détection par autoradiographie
```
51
à quoi sert la technique Buvardage Southern?
permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
52
composantes pour PCR
- ADN patient
- amorces; oligonuclétodies permettant a la réaction de commencer
- polymérase
- nucléotides
- tampon (ions, mg)
- autres additifs si nécessaires
53
meilleure ADN polymérase?
Taq
| **toutes les polymérases peuvent faire des erreurs
54
comment ce déroule un cycle de PCR?
```
dénaturer
hybrider (refroidie)
dénaturer (réchauffe)
**passe de simple brin à double brin
=on double quantité ADN à chaque cycle
```
55
comment trouver le nombre de molécules ADN produites par PCR?
2^n
| *n=nombre de cycles de pcr
56
but du PCR migration
permet de détecter les insertions ou les délétions
*électrophorèse capillaire des produits PCR
=détection du signal; la distance ou se situe la bande par rapport au puit réflète sa taille
57
applications du PCR-migration
analyses d'identités génétique; instabilités des micro satellites, contaminations foeto-maternelle, judiciaire
*insertions et délétions récurrentes
58
principe du PCR-digesiton
digestion d'un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnait une séquence spécifique
*mutation crée ou abolit site de restriction
59
EcoR1 coupe à ...
G_AATTC
60
DraI coupe à ..
TTT_AAA
61
applications du PCR digestion
mutations ponctuelles récurrentes
| *on trouve un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l'on recherche
62
est-ce qu'un mismatch en 3'permet une extension?
| ASPE
non!
| extension seulement si match en 3'
63
nom de la technique incluant un appareil d'électrophorèse très complexe permettant une précision de 1 nucléotide?
séquencage de Sanger
64
dans le séquençage de Sanger, comment la chaine se termine?
ddNTP ne contient pas de OH au segment C3 du ribose!
| empêche de se lier au prochain dNTP
65
quelle est la caractréstique d'un PCR en temps réel?
réaction PCR et détection du produit en continue!
| *discrimination allélique est quantification (relative/absolue)
66
comment fonction la sonde TaqMan?
- sonde possède un rapporteur et un quencheur
- sonde se lie à ADN et à l'amorce
- Taq libère rapporteur= fluorescence
67
selon la méthode de PCR en temps réel, un échantillon prend 24 cycles pour atteindre le seuil (RFU) et le deuxième prend 24 cycles. quel échantillon avait le plus ADN?
le premier!
| le deuxième avait 2 fois moins ADN au départ
68
donner les étapes de la technique de PCR MLPA
- dénaturation
- hybridation des 2 portions de la sonde (1 nucléotide de distance)
- ligation des 2 portions de la sonde par ligase
- amplification PCR de la sonde fusionnée
- électrophorèse capillaire
69
avantages d'un séquençage de nouvelles générations?
-multiplier infos obtenus par analyse
-possible d'analyser plusieurs gènes, voir plusieurs patients en même temps (codes barres moléculaires!!)
(on compartimente le séquençage)
70
quelle est la manière la plus simple de pouvoir faire une fragmentation de ADN?
sonication
| possible par nébulisation et digestion
71
nommer les 2 techniques d'amplification en parallèle
PCR-émulsion
PCR-cluster
(permet de faire plusieurs réaction de PCR en même temps de différents ou de même patients)
72
que ce passe t-il à l'étape d'analyse bioinformatique 1?
génération de plusieurs milliers de séquences d'environ 100 à 150 pb
=les séquences peuvent être attribuées à chaque patient selon un code barre moléculaire
73
que ce passe t-il à l'étape d'analyse bioinformatique 2?
- alignement des séquences au bon endroit du génome humain
- voir si varation
- estce que ces variations sont pathologiques
- est-ce que présent sur gènes variations présentes sur gènes pouvant expliquer le phénotype de patient
74
combien avons de MB et de nucléotides dans exome?
30 MB et 30 nucléotides (soit 20 000 variants)
75
est-ce que dans ADN foetal analysé la variation est présente également chez la mère?
NON
76
la technique de PCR migration est bonne à utiliser pour trouver...
insertion/del
77
la technique PCR digestion est bonne à utiliser pour trouver...
mutations ponctuelles récurrentes
78
le séquencage Sanger est est bonne à utiliser pour trouver...
grande nbre mutation dans 1 gène
substition
petites insertion/del
detecte pas de grande anomalie
79
la technique MLPA
deletion ou duplication
