Cours 5.1: Manipulation de l'ADN Flashcards
Les acides nucléiques forme quel polymères
ADN et ARN
Les acides nucléique sont formés de quel nucléotides
4 nucléotides:
A, C, G et T pour l’ADN
A, C, G et U pour l’ARN
Quelles sont les propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques
- polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides
- composés d’
une forte charge négative - adoptent une structure en double brins
y’a t’il des groupement hydrophobe chez les a. n.
Non
Parler de la solubilité de l’ADN
- molécule très chargée
- peu de groupements hydrophobes
- sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou
la présence de substances organiques dans l’eau
Comment précipite t’on l’ADN
La précipitation à l’éthanol est la façon habituelle de précipiter l’ADN pour le
concentrer ou changer son tampon ( on peut ajouter un slv organiques => change la cste diélectrique => devient moins soluble => favorise la précipitation ( comme les protéines ) )
Expliquer les étapes de la précipitation de l’ADN
1) la précipitation consiste en l’ajout de 2.5 volumes d’éthanol à une solution
contenant de l’ADN et 0.25M d’acétate de sodium (pour éviter le séparation des
double brins d’ADN)
2) la solution est ensuite mise à -20°C pendant au moins 30 minutes et l’ADN est
récupéré par centrifugation à 10,000 rpm pendant 10 minutes à 4°C dans une
microcentrifugeuse
3) une certaine quantité de sels sera aussi précipité avec l’ADN. Des lavages
subséquents avec de l’éthanol permettra de les enlever.
Quel autre slv organique p-e utiliser pour la précipitation
Isopropanol
Qu’est ce que l’extraction de l’ADN au phénol
- méthode de partition de phase :
les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des deux phases.
Quelle sont les trois phases récupérer après l’extraction du phénol
Haut => phase aqueuse ( ADN et ARN
interface => protéine
bas => phénol
À quel pH doit on ajusté le phénol ( pk )
pH autour de 8 (l’ADN est partiellement soluble dans le phénol acide)
Expliquer les étapes de l’extraction de l’ADN avec du phénol
- agiter doucement 1 vol du phénol neutralisé avec 1 vol de la solution contenant de l’ADN et extraire 2 fois
- les traces résiduelles de phénol peuvent être éliminées par extraction avec de chloroforme immédiatement après
- le chloroforme est éliminé facilement par précipitation avec de l’éthanol
- très fréquemment des protéases, telle que la protéinase K, sont utilisées pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol
=> Récupérer l’ADN
Est ce qu’on peut utiliser l’électrophorèse avec l’ADN ( pk )
Oui , les acides nucléiques sont des molécules chargées (négativement), elles
peuvent migrer dans un gel d’électrophorèse
Est ce qu’on peut utiliser des gels de polycrylamine
à cause de leur grande taille, les acides nucléiques pénètrent difficilement dans les gels de polyacrylamide ( possible juste pour une centaine de nucléotides )
Quel gel utilise t’on pour purifier et analyser les acides nucléiques
gels d’agarose
- ces gels, contenant de 0.5 à 2% d’agarose, permettent de séparer des fragments d’ADN de quelques centaines à plusieurs milliers de nucléotides
Comment forme t’on un gel à partir de l’agarose
l’agarose est dissous dans un tampon, puis bouilli. Lorsqu’il refroidit, il polymérise spontanément (comme du Jell-O) et forme un gel
Quel est le matériel nécessaire pour l’électrophorèse avec le gel d’agarose
l’agarose non-polymérisé est coulé dans le moule (photo ci-dessous) pour prendre la
forme voulue; le peigne (comb) permettra de créer les puits (wells) où seront chargé
les échantillons d’ADN
Est ce qu’On voit l’ADN migrer sur le gel
Non , il est transparent
Comment on colore les bandes d’ADN
- Utilise des colorants comme le bromure d’éthidium
- ce sont des molécules aromatiques cationiques planaires qui s’intercalent entre les bases
- lorsqu’elles sont intercalées, elles fluorescent plus intensément qu’à l’état libre
Expliquer le déroulement de l’électrophorèse de l’ADN
l’ADN est chargé dans les puits du gel et migrera vers l’anode lors de l’électrophorèse
- on utilise un tampon contenant de l’EDTA pour inhiber l’activité des nucléases qui peuvent être présente dans la solution; le pH du tampon est autour de 8
- comme pour les protéines, la séparation s’effectuera selon la masse moléculaire de l’ADN, qui dépend de la taille des fragments d’ADN:
=> fragments petits migrent plus rapidement que les grand
Quel est la relation entre le logarithme du poid moléculaire de l’ADN et de sa distance de migration.
Relation directe => on peut déterminer la taille du fragment en connaissant la migration
Nommez 3 technique qui peuvent être utilisé pour la purification des a.n. et dites ils sont utilisées pour quoi exactement
- chromatographie par échange d’ions: puisque l’ADN et l’ARN sont de charge négative, un échangeur anionique sera utilisé.
=> Surtout utilisée pour purifier des oligonucléotides - filtration sur gel: surtout utilisée pour déssaler des oligonucléotides (de 10 à 100 nucléotides)
- chromatographie d’affinité: utilisé pour purifier les ARNm des cellules eucaryotes ces ARN possèdent un queue de poly(A) à leur extrêmité 3’ ->
peuvent être purifiés sur une colonne d’agarose à laquelle on a greffé une séquence de poly(U)
Quel ultracentrifugation est utilisé pour purifier l’ADN
- l’ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium
- la densité de flottaison de l’ADN dans un tel gradient dépend de sa composition
en bases selon l’équation:
p = 1,660 + 0,098X G+
L’ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium est utilisé pour séparer quoi
- l’ADN nucléaire de l’ADN mitochondrial ou chloroplastique
- les plasmides de l’ADN chromosomal des bactéries
