Cours 1 : Isolation des protéines Flashcards
Quelle est la première étape dans la purification des protéines
les dissoudre dans une phase
liquide à partir de laquelle on peut commencer la purification
Vrai ou faux : dans la méthode d’isolation des prots les protéines reste ds les cell.
Faux, les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
Quelle est la méthode la plus douce et la plus simple d’isolation des prots
La lyse osmotique
Qu’est ce que la lyse osmotique
- les cellules sont resuspendues
dans une solution hypotonique - cette différence en concentration résulte dans l’établissement d’une
pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule
Qu’est ce qu’une sln hypotonique
solution dont la
concentration molaire en solutés est inférieure
à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule
La lyse est particulièrement efficace avec quelle type de cell. et pk
Les cell. animales => ne possède pas de paroi cellulaire
Qu’est ce que la lysozyme , quand est elle nécessaire
avec des cellules bactériennes, de levures ou végétales,
- une enzyme qui dégrade les parois cellulaires,
Lors de l’isolation des prots la plupart des tissu exige quoi? Ca permet quoi ?
- désintégration mécanique
- afin de briser les cellules et permettre l’accès à leur contenu interne
Ex: lorsqu’un analyse un tissu
Quelles sont les techniques utilisées lors dune désintégration mécanique ( isolation des prots )
- broyage avec du sable, de l’alumine ou des billes de verre de petite
taille; - déchiquetage mécanique (blender de type Waring) ;
- homogénéisateur (Potter en téflon) ; piston qui brise le tissu
- rupture par haute pression (French press) ;
- sonication par vibration ultrasoniqu
Quel est le nom du résidusune fois les cell. brisés
Lysat: c’est le produit de la lyse des cell. ( avec toutes les organites )
Que peut t’on faire avec le lysat pour récupérer les protéiunes
Il p-t filtré ou
centrifugé afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant ainsi
la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution
Voir les étapes de centrifugations différentiells
Figure 1 diapo 7
Chaque organite peut être identifié par certains
Marqueur moléculaire qui permettent de confirmer la présence des organite dans une substance
Quel sont les Facteurs desquels dependent l’intégrité structurale des protéines et leur stabilité
- PH
- Température
- Protéases
Comment stabiliser le pH lors de la purification des prots
- utilise des solutions tampon qui maintiennent le pH dans une zone “physiologique”
(6.5-7.5/8.0) pour éviter d’endommager les protéines par des variations brusque
de pH
Expliquer l’impact de haute T sur les prots ? la T ambiante
-les protéines sont facilement dénaturées à hautes températures
- plusieurs protéines se dénaturent lentement lorsque conservées à 25°C
La purification se fait à quelle T et une fois purifiées se garde à quelle T
- la purification des protéines se fait normalement à des températures proches
de 0-5°C - une fois purifiées, les protéines peuvent se conserver à long terme à des
températures de –20 à -80°C
Qu’est ce que les protéase
- enzymes qui hydrolysent les liens peptidiques
- ces protéases sont libérées lors de la lyse cellulaires et peuvent dégrader les
protéines lors de la purification
- ces protéases sont libérées lors de la lyse cellulaires et peuvent dégrader les
Comment empêcher que la protéase aille dégrader les protéines
- l’ajout d’inhibiteurs de protéases permet d’empêcher cette dégradation
Les prots sont purifiées par quelle méthode
méthodes de fractionnement
Expliquer de manière large les méthodes de fractionnement
- on utilise les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine étudiée
pour l’isoler progressivement des autres substances cellulaires
Quelles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes techniques de
séparation
- la solubilité
- la charge ionique
- la taille moléculaire
- les propriétés d’adsorption et de liaison à d’autres molécules biologiques
Quelle sont les proptiété physico chimique que l’on regarde lors de la technique de séparation et quelle technique y sont associée
solubilité => précipitation
charge ionique
=> chromatographie par échange d’ions
=>électrophorèse
=>focalisation isoélectrique
taille moléculaire
=>ultracentrifugation
-=>chromatographie par gel
=> filtration
=>électrophorèse
spécificité => chromatographie d’affinité
Qu’est ce que la déf. large de la précipitation
- diminuer sélectivement leur solubilité dans l’eau
Quels sont les type de résidus qui influence la solubilité des protéines
Les acides aminés que contiennent les protéines
- hydrophobe
- type polaire ou chargés
Améliore ou diminue la solubilité
La solubilité d’une protéine dépend de quoi
a) des interactions polaires avec le solvant aqueux
b) des interactions ioniques avec les sels en solution
c) des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge
similaire
Comment les facteurs influence la solubilité de la prots
- ces facteurs augmentent les interactions avec la solution et diminuent
les interactions protéines-protéines, empêchant l’agrégation des protéines
Explique la répartition des charges et des régions hydrophobe
- les régions non-polaires constitueraient
plus de 50% de la surface des protéines globulaires - Autres régions est une régions chargés ( + ou - )
Est ce que les molécules d’eau sur une molécule se répande de manière égale
Non , ca dépends des protéines à la surface, les prots hydrophile ont + d’intéraction et les parties hydrophobe sont - entouré
La distributuion des charge est t’elle la même pour chaque protéine
Non , car chaque prots est constituer de diff. a.a. ( qui influence la solubilité )
Donnez les carctéristique du slv utilisé dans l’isolement des prots
- toujours aqueux,
- mais ses
propriétés peuvent être changées pour que la solubilité d’une protéine soit modifiée
La précipitation exige quoi
- la formation d’agrégats de protéines
- à partir d’une certaine taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour
contrecarrer celle de la force gravitationnelle, ce qui mène à la précipitation
Comment peut t’on diminuer la solubilité d’une prots
- la force ionique (concentration saline)
- modification du pH
- ajout de solvants organiques
- ajout de polymères inertes
La concentration en sel est représenter par quoi
La force Ionique
I = 0,5 ( E ci x Zi^2)
ci
représente la concentration de chaque espèce ionique i et Zi
est leur charge
électrique
La solubilité d’une protéine dans un solution varie selon quoi
selon la nature
des ions en solution et augmente avec la concentration de
sels en solution
A faible force ionique il y a une augmentation ou diminution de la solubilité
Augmentation
dans la zone de force ionique de zéro à 0.5M, l’augmentation en solubilité
avec une concentration croissante en sels est connue sous le nom de
Salting in
Comment on explique le salting in
à ces concentrations, les sels lient directement les protéines et augmentent
leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité parce que:
- les sels augmentent les interactions avec l’eau
- les sels augmentent la répulsion entre protéines (¯ agrégation)
la solubilité des protéines de type globulaire décroît ou augmente avec la diminution de
la concentration de sel?
Décroit
La propritété ( que la solubilité des protéines de type globulaire décroît avec la diminution de
la concentration de sel) peut être utile quand ds la purification
dessaler la protéine par dialyse
Quelle est une des techniques les plus utilisées en purification des
protéine
Dessalage ( salting out )
Ce phénomène de salting out est du à quoi
Ce phénomène est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés
et les protéines pour la solvatation (i.e, accès aux molécules d’eau)
L’hydratation des ions de sels a tendance à quoi
a une forte tendance à séquestrer les molécules
d’eau
la séquestration de l’eau résultera en quoi ( dessalage )
une diminution de la solvatation des prots
Que ce passe t’il une fois qu’une quantité suffisante d’eau a été sequestrées
les
protéines auront moins de surface solvatée, ce qui favorisera leur agrégation
Le dessalage est une fct de quoi
l’hydrophobicité de la protéine:
les régions hydrophobes seront les premières à être moins bien solvatée
Résumé c’est quoi le dessalage d’une protéine ( voir figure 10- diapo 26 )
- une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la
surface d’une protéine. - au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules
d’eau libres deviennent peu nombreuses. - Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des
molécules d’eau autour des résidus hydrophobes
=>ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes
exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec
de l’eau
Pk la nature des sel est imp pour la précipitation des prots
les sels qui se lient et interagissent
directement avec la protéine peuvent avoir un effet déstabilisant et
sont désignés « chaotropiques »
Quel sont les sel optimaux
ceux qui encouragent :
- l’hydratation des régions polaires
- la déshydratation des régions hydrophobes
chez une protéine sans
avoir aucune interaction avec la protéine
QU’est ce que la série Hofmeister? Qu’est ce qu’il a démontré
Classe les ion qui favorise la solubilité et ceux qui favorisent la précipitation
Hofmeister a montré, en 1888, que certains ions favorisent la précipitation des
protéines à haute concentration (salting out) alors que d’autres favorisent leur
solubilisation à faible concentration (salting in)
Quel sont les sel qui favorise la précipitation
- les anions multivalents comme
le sulfate, le phosphate et le
citrate avec des cations comme
le potassium, le sodium et
l’ammonium sont préférés. - le sel utilisé le plus couramment
en précipitation de protéines
est le sulfate d’ammonium
(NH4)2SO4
Résumé le Salting in
augmentation de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de
faibles concentrations de sels
- les ions salins interagissent directement avec les protéines
- les ions de même charge augmentent la répulsion entre protéines, ce qui
réduit leur agrégation => favorise leur solubilité - ces ions (qui sont hydrophiles) augmentent les interactions des protéines
avec le solvant aqueux => favorise leur solubilité
Résumé du salting out
Diminution de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de
hautes concentrations de sels.
- les ions salins n’interagissent pas avec les protéines
- l’ajout de hautes concentrations de sels très hydrophiles amène la
séquestration des molécules d’eau par ces ions - la quantité de molécules d’eau disponible pour solubiliser les protéines
diminue - les régions hydrophobes des protéines seront déshydratées en premier
lieu ce qui favorisera le rapprochement des régions hydrophobes des
protéines (via interactions hydrophobe ->effet goutte d’huile)
Qu’est ce que la précipitation différentielle
Les prots précipite pas toutes à la même force ionique
=>En fct de la force ionique ds la sln certain font précipiter à des forces ionique plus basse ( en fct des a.a.)
Vrai ou faux : les protéines sont constituées de nombreux groupes ionisables possédant des pKa
pareil
FAUX : les protéines sont constituées de nombreux groupes ionisables possédant des pKa
différents
QU’est ce que le pnt ou PH isoélectrique
- chaque protéine possède un point ou pH isoélectrique
- il y a autant de charges
positives que de négatives=> harge global de la prots est de 0
Quel est l’impact sur la solubilité du pH isoélectrique
au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir moins soluble: - une protéine
avec une charge globale nette près de zéro minimise la répulsion électrostatique
et permet aux forces électrostatiques locales de prédominer menant ainsi à une
attirance entre les molécules =>agrégation => précipitation
Le phénomène de précipitation isoélectrique ( - solubilité au pH isoélectrique ) permet quoi
Permet de
purifier une protéine sélectivement en amenant le pH au point isoélectrique de
cette protéine
Quel est l’impact de l’ajout d’un slv miscible avec l’eau
l’éthanol ou l’acétone, à un
mélange contenant des protéines diminue leur solubilité
le pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée décroît ou augmente avec la
concentration du solvant organique dans la solution? Pk?
Décroit
- ceci serait attribuable à une réduction de la constante diélectrique de la solution
- constante diélectrique: reflète la polarité d’un solvant
=> log ( S/ So) = -K’ / D^2
K’ : cst d’équilibre
D: cst diélectrique
Expliquer l’impact des slv organiques sur la solubilité des prots
- Les solvants organiques diminuent l’hydratation de surface et augmentent la
surface hydrophobe
=> favorise l’agrégation des protéines, comme le dessalage - l’agrégation est provoquée par l’interaction entre des régions possédant des
charges opposées
Expliquer l’impact de la taille de la prots pour la solubilité ds un slv aqueux / organique
- plus grande est la protéine, plus basse est la concentration
en solvant organique nécessaire afin de la précipiter
=> les protéines plus larges possèdent une surface plus grande, donc
une meilleure chance d’avoir une région à la surface chargée qui est
complémentaire avec une autre protéine=> qui favorise le phénomène la précipitation
