Cours 2: Chromatographie Flashcards
La chromatographie est basé sur l’utilisation de quelles phase
Phase mobile
Phase stationnaire
Que se passe t’il à la phase mobile:
contient le mélange de substances à
fractionner
Que ce passe t’il lors de la phase stationnaire
au travers de laquelle les substances sont
séparées
Que se passe t’Il lorsque les différentes substance interrragissent avec la phase stationnaire
ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les
propriétés respectives de chaque substance
Quelles sont les propriétés utilisées pour effectuer le fractionnement
- les interactions ioniques (Chromatographie par échange d’ions)
- la taille (Chromatographie par gel-filtration)
- la spécificité (Chromatographie d’affinité
- pour chaque propriété il y a un type de chromatographie
Explique la chromatographie par échange d’ions
dans un processus d’échange d’ions, les ions liés électrostatiquement à un support
insoluble (R) sont remplacés de manière réversible par des ions en solution:
R+ A- + B- <=> R+ B-+ A-
*R+ A- est un échangeur d’anions, sous la forme A-
Qu’est ce qu’un échangeur d’anions
un échangeur de d’anions porte des groupes chargés positivement (R+
) et lierait
des anions de manière réversible
Qu’est ce qu’un échangeur de cations
un échangeur de cations porte des groupes chargés négativement (R-
) et lierait
des cations de manière réversible
Les protéines se lie à un échangeur d’anion ou de cation ?
Les deux , les protéines portent à la fois des charges positives et négatives et peuvent lier à
la fois un échangeur d’anions ou de cations
De quoi dépend l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions
1) du pH de la solution, puisque la charge nette des protéines varie selon le pH
2) de la nature et des concentrations des autres ions en solution, qui vont aussi
compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions
Quelles sont les deux caractéristiques importantes desquelles dépendent les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines
- La nature de leur matrice.
- Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser
l’attachement de la protéine
Qu’est ce qu’une matrice
Surface sur laquelle les échangeurs sont greffés de manière cpvalente ( inerte et solide )
De quoiest constituer une matrice
- les matrices utilisées en chromatographie sont des polymères insolubles
préparés sous formes de billes, appelées familièrement résines - les polymères le plus souvent utilisés sont des polysaccharides comme le cellulose
ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères
- les polymères le plus souvent utilisés sont des polysaccharides comme le cellulose
Quel est l’avantage d’avoir des polyssaccharide comme polymère qui constitue une matrice
- ces polymères sont suffisamment poreux afin de permettre la pénétration d’une
protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la
surface de l’extérieur de la bille
Chromatographie prends quelle forme
Colonne
Quelles sont les deux classes d’échangeurs
- les échangeurs anioniques qui portent une charge positive
- les échangeurs cationiques qui possèdent une charge négative
les échangeurs d’ions exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine
à un pH donné qui leur permettent d’interagir par quelle force
Attraction électrostatique
Les deux classes d’échangeurs se divise en sous classe quelles osnt elles
- « échangeur fort » qui reste
pleinement chargé entre pH ~ 3 et ~ 10 - « échangeur faible » qui est chargé
dans une gamme de pH plus restreint.
Combine de groupement chimique sont greffés sur des matrices
4 ( plusieurs type d’échangeurs qui garde leur charge dans un pH très large )
Où les protéines se leint aux échangeur et par quel force
- force électrostatique
- entre la
surface de la protéine et les groupements chargés sur l’échangeur
Qu’est ce que doit bouger la protéine pour s’attacher ? Pourquoi sont t’ils la
- les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions
(ions métalliques, des ions de sel, ou des ions du tampon).
-Une protéine doit alors déplacer les contre-ions pour s’attacher
Est ce que la protéine est égalemet neutraliser par des contre-ions ? qu’est ce que ca engendre
Comme la protéine est également neutralisée par des contre-ions, la protéine doit
posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle
doit déplacer
Qu’est ce que influence le pH et la concentration saline pour la prots
Ils sont choisis de sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ion, Il faut trouver l’envirronnement optimale pour que la prots gagne contre les contre-ions de l’échangeur
liaison à la collone ( voir figure 2 )
Diapo 8
Que se passe t’il une fois la solution de protéines est appliquée sur le haut de la colonne contenant
l’échangeur
la colonne est lavée avec une solution tampon
Vrai ou faux les enzyme et l’hémoglobine se lie avec la même affinité
Faux , les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités
différente
Expliquer les processus d’élution fractionnée
- les protéines liées à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de
concentration saline supérieure au tampon de lavage
Expliquer le gradiant sur la collonne en fct de l’affinité des protéine
- les protéines ayant une affinité relativement faible pour l’échangeur
d’ions migreront plus rapidement dans la colonne que celles qui lient
l’échangeur avec une plus forte affinité - plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte,
plus la migration sera retardée
Qu’est ce qui est utilisé fréquemment pour l’élution
KCl et NaVCl, stabilise les protéine et n’encourage pas la précipitation
Qu’est ce qui déplace la protéine lors de l’elution
le sel déplace directement la protéine;
les ions occupent les sites chargés
devenus disponibles et bloquent le
rattachement de la protéine
Quelle élution est plus précise
Par gradient pcq fractionnée on se débarrasse rapidement ( change rapidement la concentration de sel ) de toutes les protéines qui ont des faibles affinité, il y a des contaminant dans l’élution fractionnée pcq une protéine avec une affinité similaire va également découler
Expliquer l’élution par gradient
- l’utilisation d’un gradient linéaire,
où la concentration saline de la solution d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne - permet de libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions selon leur affinité
Qu’est ce que le but de l’Élution
récupérer la protéine et la décoller de la colonne ( après que le lavage s’est débarrassé des autres protéines non désirable )
Selon quoi les protéine son séparé dans la chromatographie par gel filtration
les molécules sont séparées selon leur
taille et leur forme
Quels sont les trois principes de la chromatographie par gel-filtration
1) la phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulé
possédant des pores, fabriqué sous forme de billes
2) les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille
3) les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes
Quel sont les protéines qui passe plus vite ( gel-filtration )
Les plus grosse ( ne passe pas dans les port)
Comment se nomme la limite qui ne permet pas à certaines grosseur de passer
limite d’exclusion
La masse des protéine est esprimé par quelle unité
Dalton =>On exprime la masse des protéines en kilodaltons ou kDa
Combien de pourcent excluent les meilleures billes de gel
90%
des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des
macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes
Les matrice utilisé lors de la chromatographie par gel son constituer de quoi
les matrices utilisées sont faites de polymères insolubles à base de
polysaccharides :
- le dextrane (Sephadex)
- l’agarose
(Sépharose), - de polyacrylamide (Bio-Gel),
préparées sous la
forme de billes réticulées (poreuses)
Entre quoi varie les limites d’exclusion ( chromatographie par gel )
les limites d’exclusion varieront de 0.8 à 800 kDa pour le Sephadex,
et jusqu’à 40 000 kDa pour le Sepharose
La porosité des gels dépende de quoi
- de la masse moléculaire du polymère
- du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontages)
Vrai ou faux dans des conditions optimales, tous les
pores sont accessibles aux protéines,
Vrai ,mais pas n’importe quelle taille de protéines peuvent y accéder
Si mes protéines sont très proche en taille est ce qu’une petite colonne suffit
Non, on doit graduer davantage
Qu’est ce que le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve)
le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne
Quelle protéine sont élués en premier (gel-filtration )
Les plus grosses
Quelle est l’équation des volumes
Vt = Vx + Vo
Vx = le volume occupé par les billes
Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt)
Vt = le volume total de la colonne
Les protéines qui passe par le pore seront élués en fct de quoi
leur masses moléculaires
Qu’est ce que le volume d’élution relatif et comment le calculke
- Ve/Vo
- un volume d’élution dépend de la longueur de la colonne, mais c’est le volume d’élution diviser par le volume mort
- Change pas pour une protéine
Le volume d’élution relatif permet de mesurer quoi? comment on la calcule cette valeur garce au volume d’élution relatif ?
- la masse moléculaire d’une protéine
- il existe une relation linéaire entre le volume d’élution relatif d’une protéine
et le logarithme de sa masse moléculaire
La dialyse permet quoi, expliquer les pores permettent quoi
- permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines
- ces pores permettent aux petites molécules, comme les sels et les métabolites, de diffuser au travers de la membrane, mais empêchent la diffusion de plus grosses molécules
Les membranes lors de la dialyse sont à base de quoi
cellophane (cellulose)
La dialyse est frequemment utilisé pour quoi
utilisée pour éliminer les sels présents dans
un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après
élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par
échange d’ions
Expliquer les étapes de la diaslye ( gros principes )
la solution de protéines et de sels est mise à l’intérieur d’un sac à dialyse, puis immergée dans un large volume de tampon. Après plusieurs heures, les solutions se retrouveront à l’équilibre grâce à la diffusion des sels de l’intérieur du sac vers le tampon de dialyse
Expliquer une forme de dialyse qui a recourt à la centrifugation
Centrifugation sur colonne filtre
- Utilise une membrane poreuse pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire
=> La taille des pores dicte la limite d’exclusion des protéines
Si on va à l’équilibre il y a encore du sel à l’intérieur de la membrane lors de la dialyse comment on fait pour s,en débarrasser
On fait la dialyse plusieurs fois
Qu’est ce qui se lie à la matrice poreuse et inerte dans la chromatographie d’affinité
un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est fixé de manière covalente
Comment fait on lors de la chromatographie d’affinité pour récupérer la protéine lié au ligand
- on peut alors récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant
les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand - soit en ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne ( celui-ci entre en
compétition pour la liaison de la protéine) ou en changeant le pH, la force
ionique et/ou la température
Que se passe t’il dans la chromatographie d’affinité quand une sln contenant un mélange de protéine traverse la colonne
la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines
ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne
Quel sont les grand avantage de la chromatographie d’affinité
- d’exploiter les propriétés biochimiques
uniques de la protéine d’intérêt, au lieu d’utiliser des propriétés physico-
chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines - possède aussi l’avantage de pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très
haut degré de pureté en une seule étape
Par quelle équation peut représenté la liaison protéine-ligand. Commengt change t’elle si il y a une matrice
Kd
P + L<=> P-L
Kd' P + L-M <=> P-L-M
Qu’est ce que le Kd
la constante de dissociation (une mesure de l’affinité protéine-ligand) ( plus le Kd est grand plus l’affinité est faible )
la liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer avec quoi
l’interaction protéine-ligand
-> le Kd’ devrait varier entre 10^-4 M et 10^-10 M
la quantité de protéine retenue sur la colonne (P-L-M) dépendra de quoi
- du Kd’ (l’interaction est trop faible si la valeur >10-4 M)
- de la concentration de protéine dans l’extrait
- du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M)
Quelle sont les caractérsitique de la matrice dans la chromatographie d’affinité
c- himiquement inerte
- avoir une grande porosité
- présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de
former des liens covalents avec les ligands
Quelle est le polymère le plus frequemment utilisé pour la matrice de la chromatographie d’affinité
L’agarose
La liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose se fait
en deux temps expliquez les
1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène,
qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit
lié par covalence
interférence stérique avec la matrice d’agarose cause quoi? Comment remédier à ce problème ?
- plusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène
- pour éviter ce problème, un bras “espaceur” souple est
ajouté entre la matrice et le ligand
Il est important après la chromatographie de permettre de détecter les protéines dans les sln qu’on récupère; Quelles sont les 5 méthode de détection et les caractéristique de ces méthodes
- absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre
- les protéines absorbent la lumière autour de 280nm
- méthode non spécifique
- essai colorimétrique (essai de Bradford)
- contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une
couleur mauve à la solution -> l’intensité de la couleur est
proportionnelle à la concentration de protéine en solution - méthode non spécifique
- essai enzymatique
- pratique si la protéine à purifier est une enzyme
- détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant)
- permet de déterminer le degré de pureté de la protéine
- détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot)
- très spécifique
Faites un sommaire des trois méthode de chromatographie garce à la diapo 31
