Cours 3 : Activité enzymatique Flashcards
Donne les trois role des enzyme au niceau du fonctionnement des cell
Elles accélèrent les réactions chimiques de plusieurs ordres de
grandeur
* Abaissent l’énergie d’activation des réactions chimiques
Elles contrôlent la stéréospécificité des substrats et produits de ces
réactions
=> ex: seulement les acides aminés de type L sont utilisés lors de la synthèse protéique
- Elles constituent des sites de régulation des différentes voies
métaboliques ( Les enzymes aident à spécifier les voies réactionnelles du substrat)
=> ex: le produit d’une voie métabolique peut contrôler l’activité d’une des enzymes
sa voie de synthèse pour mieux réguler son niveau de production.
Qu’est ce que la cinétique enzymatique
l’étude de la vitesse des réactions enzymatiques
Quelle sont les paramètres importants ds les rct enzymatique
– affinité enzyme-substrat
– vitesse de réaction
– inhibition des réactions
Donné une équation d’une rct chimique simple et la vitesse de cette rct
A → P
v = d[P] / dt = k [A] donc : k = v / [A]
Qu’est ce que le K dans l’équation de vitesse
k est une constante de vitesse qui reflète la vitesse “intrinsèque” de cette réaction chimique:
=> proportion de molécules transformées par seconde
Nommez les 3 étapes d’un rct catalysée par une enzyme + quelle est le problème avec ce mode de représentation
1- Le substrat se lie à l’enzyme pour former un complexe enzyme-substrat
2- La transformation du substrat a lieu dans le site catalytique de l’enzyme et on obtient un
complexe enzyme-produit
3- Le complexe enzyme-produit se décompose pour relâcher le produit
** Problème la concentration du complexe enzyme produit et enzyme substrat est inconnue alors c difficile de tirer bcp d’info de cette rct
Vrai ou faux : les étape 1 et 3 de la catalyse sont réversible mais pas l’étape 2
FAUX : En théorie, toutes ces réactions sont réversibles
Donné l’équation de Michaelis-Menten et les diffrérents K
E + S <=> ES → P + E
k1 : rct directe
K-1: rct inverse
K2: Es => P
Donnez les deux étapes d’une rct catalysée par une enzyme ( qui a été simplifié par Michaelis et Menten)
1) l’enzyme (E) et le substrat (S) se combinent pour former un complexe enzyme-
substrat (ES)
2) la réaction chimique à lieu dans le complexe ES et il y a formation du produit (P)
Quel est l’hypothèse fait par Michaelis et Menten qui touche la rct inverse et permet leur équation
on fait l’hypothèse que la réaction inverse où le produit se recombine
avec l’enzyme pour reconstituer le complexe ES est tellement rare qu’on peut l’ignorer.
Écrit l’équation de la vitesse avec l’équation de M-M
v = k2 [ES]
où [ES] est la concentration du complexe enzyme substrat
Comment peut on appeller le K2 dans l’équation M-M et il représente quoi
La constante k2 est souvent appelée kcat (constante catalytique): elle représente la
constante de vitesse qui est égale au nombre de molécules de substrat transformées
par chaque molécule d’enzyme par seconde (turnover number)
Comment ds l’équation M-M on peut déterminer la concentration de ES
Nous connaissons la concentration d’enzyme totale [E]T , qui
correspond à:
[E]T = [E0] + [ES]
Cependant, nous pouvons faire deux
assomptions:
1- comme la concentration de substrat
est saturante, [ES] = [E]T
2- dans une réaction enzymatique,
avec une concentration de substrat
saturante, la concentration de [ES]
ne variera pas au cours du temps
- Dans ces conditions on peut calculer la concentration de ES
Comment trouve t’on la vitesse de la rct enzymatique de M-M
V = kcat [ES]
Donc, en modificant la valeur de [ES] on obtient l’équation de Michaelis-Menten:
V= ( kcat [Eo ][ S])/(Km +[S ])
km = (k-1 + Kcat )/ K1
Expliquer à quel moment [ES] = [E0]
Lorsqu’on augmente la valeur de [S] à des niveaux de plus en plus haut, on fait en sorte que
toutes les molécules d’enzyme seront saturées par des molécules de substrat.
Que ce passe t’il lorsque [ES] = [E0] en ce qui concerne la vitesse
Dans ces conditions la vitesse de la réaction aura atteint son maximum et on pourra écrire:
Vmax = kcat [E0]
Donnez une autre manière d’écrire l’éq. de M-M
V= Vmax[s ]/ Km+[s ]
le Km correspond à quoi en fct de la vitesse
Donc, le Km correspond à la concentration de substrat à laquelle la vitesse V est à la moitié de la vitesse maximale
Expliquer la relation entre le Km et l’affinité de l’enzyme pour le substrat
- La valeur du Km est donc une valeur approximative de l’affinité du substrat pour l’enzyme (mais ce n’est pas toujours le cas)
- Plus la valeur du Km est faible, moins il faut de substrat pour saturer le site actif d’une enzyme (i.e atteindre Vmax)
La valeur de Kcat / Km correspond à quoi
Une mesure de l’efficacité catalytique d’une enzyme
Comme le substrat doit nécessairement rencontrer l’enzyme pour être transformé, cette valeur ne peut pas être plus grande que la limite de diffusion des molécules dans l’eau,
soit 108 à 109 M-1s
-1
La pente de la droite sur le graphique du produit en fct du temps correspond à quoi ? Que ce passe t’il plus t’augmente la concentration du substrat ?
La vitesse
Plus la pente augmente
- Si on représente chaque valeur de v en fonction de la [S] sur un graphique, on obtient quoi
- Cette courbe plafonne au Vmax
- à ½ Vmax, la concentration de
substrat correspond au Km
Donnez un autres exemple de représentations graphiques dérivées de l’équation de
Michaelis-Menten qui permettent de mesurer plus précisément les valeurs de KM et Vmax
Une d’entre elle est l’équation de Lineweaver- Burke:
1/V = [ Km / V max ] (1 / [ S] ) + 1/ Vmax
- Elle est représentée par un graphique 1/v versus 1/[S]
Donné des avantage de la représentation graphique de ’équation de Lineweaver- Burke
- Donne une ligne droite dont la pente
correspond à KM/Vmax - l’intersection de la droite avec l’axe
des Y correspond à 1/Vmax - l’intersection de la droite avec l’axe
des X correspond à -1/KM - Cette approche permet d’obtenir
des valeurs de KM et Vmax
plus précises que celles obtenues
avec un graphique de type
Michaelis-Mente
Donné des inconvénients de la représentation graphique de ’équation de Lineweaver- Burke
Si elle ne sont pas répartie de facon égale les endroits plus concentrés sont plus proche de l’Axe des y
Donné une déf. des inhibiteurs
Plusieurs substances peuvent affecter l’activité catalytique d’une enzyme, soit en
affectant la liaison de son substrat ou son cycle catalytique (turnover number)
Expliquer briévement le lien inhibiteur-enzyme
- Vont se lier au site actif de l’enzyme
- Ne réagiront pas ou peu avec l’enzyme
Donné des exemples de médicaments qui sont des inhibiteurs d’enzymes spécifiques:
- méthotrexate -> inhibe la dihydrofolate réductase
- 5-fluorouracile -> inhibe la thymidilate synthase
=> Traitement contre le cancer
Donnez les trois type d’inhibiteur
- inhibition compétitive
– inhibition non-compétitive
– inhibition incompétitive
L,efficacité d’un inhibiteur est représenté par quoi
constante d’inhibition Ki
Comme pour le KM, plus le KI est petit, plus l’affinité de l’inhibiteur pour l’enzyme est forte
Qu’est ce qu’un inhibiteur compétitif
Une substance qui compétitionne directement avec le substrat pour lier le site actif d’une enzyme est appelé inhibiteur compétitif
Donné l’éq. de l’inhibiteur compétitif
E+S <=> ES => E+P
+
I
II
V
EI
Donné l’effet sur le Vmax et le Km des inhibiteur compétitif
Dans ce type d’inhibition, le Vmax est inchangé, alors que le KM est augmenté d’un
facteur (1 + [I]/KI).
Expliquer avec les inhibiteur compétitif l’équation du Ki
Ki = [ E][ I] /[ EI]
Expliquer avec les inhibiteur compétitif l’équation de M-M
V= Vmax[s ]/ Km[ 1+ ([I]/KI) ]+[s ]
Expliquer la représentation dans le graphique de M-M lors de la présence d’inhibiteur compétitif
En augmentant la concentration
d’inhibiteur, l’enzyme requiert
une [S] plus élevée pour atteindre
le Vmax (reflète la compétition
entre l’inhibiteur et le substrat)
- Le KM observé augmente
Expliquer la représentation dans le graphique de Lineweaver-Burke lors de la présence d’inhibiteur compétitif
- On voit que toutes les droites obtenues
à différentes concentrations d’inhibiteur
croisent l’axe des Y au même endroit - même 1/Vmax
- Cette particularité est spécifique à
l’inhibition compétitive
Qu’est ce qu’un inhibiteur incompétitif
Si un inhibiteur se lie seulement au complexe enzyme-substrat (ES), et pas à
l’enzyme libre, il s’agit d’une inhibition incompétitive
Donné l’éq. de l’inhibiteur incompétitif
E+S ES => E+P
+
I
^
II
v
ESI
Donné l’effet sur le Vmax et le Km des inhibiteur incompétitif
Dans ce type d’inhibition, le Vmax et le KM sont diminués d’un facteur (1 + [I]/KI’).
Expliquer avec les inhibiteur incompétitif l’équation du Ki
Ki = [ ES][ I] /[ ESI]
Expliquer avec les inhibiteur incompétitif l’équation de M-M
Expliquer la représentation dans le graphique de Lineweaver-Burke lors de la présence d’inhibiteur incompétitif
- Une série de droites correspondant à différentes concentrations d’un
inhibiteur incompétitif seront parallèles entre elles. - Cette particularité est spécifique à ce type d’inhibiteur
Qu’est ce que l’inhibition non-compétitive
Si l’inhibiteur peut lier à la fois l’enzyme et le complexe enzyme-substrat (ES),
cet inhibiteur est qualifié de non-compétitif.
Donné l’éq. de l’inhibiteur non-compétitif
E+S <=> Es => E+P
+ +
I I
^ ^
II (Ki) ll ( Ki ‘)
V v
EI + S<=>ESI
Donné l’effet sur le Vmax et le Km des inhibiteur non-compétitif
Dans ce cas, le Vmax est diminué d’un facteur 1+ [I]/KI’
pour le KM, si l’inhibiteur a la même affinité pour E que pour ES (a = a’), il reste inchangé
Si l’affinité de l’inhibiteur pour E et ES est différente (a = a’), alors le KM
augmente d’un facteur a/a’
Expliquer avec les inhibiteur non-compétitif l’équation du Ki et Ki’
Expliquer avec les inhibiteur incompétitif l’équation de M-M
Expliquer la représentation dans le graphique de Lineweaver-Burke lors de la présence d’inhibiteur non-compétitif
- Pour ce type d’inhibition, les différentes droites vont se croiser à la gauche de
l’axe des Y. - Dans le cas où KI = KI
’ (a = a’), les droites vont se croiser sur l’axe des X
Qu’est ce que l’activité enzymatique ( elle est influencée par quoi)
L’activité enzymatique est influencée à la fois par des propriétés spécifiques à
l’enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets
non spécifiques, soit: des sels et tampons, pH, force ionique, température, et dans
certain cas d’autres protéines.
Les conditions sont arrangées pour que l’enzyme ait quelles sortes d’activité
Maximal
L’activité enzymatique nécessite quelle concentration du substrat ( + M-M )( + effet sur la vitesse )
- des concentrations
élevées de substrat qui sont parfois difficiles à atteindre - Si l’enzyme obéit à la cinétique Michaelis-Menten, une concentration de substrat
dépassant 10 X le Km doit être utilisée (Figure 1A) - À cette concentration de substrat, la vitesse mesurée représente 91% de la vitesse à
concentration infinie; des complications apparaissent si une concentration faible de
substrat est utilisée
Dans l’activité enzymatique comme doit être la vitesse ( + pk )
il est important que la vitesse soit linéaire pendant la période d’incubation
utilisée pour détecter convenablement la formation du produit de la réaction
Comme la vitese de la rct peut être compromise
S’il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par la réaction de
retour (retro-inhibition)
Quelle stratégies peut être utilisée pour pas que la vitesse de la rct soit compromise
- Mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de minimiser l’accumulation
du produit - L’utilisation de hautes concentrations de substrat
- Utiliser des pH non physiologiques (basiques si le produit de la réaction est un proton)
pour enlever le proton et déplacer la réaction dans la direction de la formation du produit - L’utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit afin de minimiser sa
concentration - l’inhibition par le substrat à des hautes concentrations peut aussi être due à la formation
d’interactions non appropriées au site actif et qui mènent à l’inhibition de l’activité
enzymatique
Les valeurs de Vmax et Km sont influencés par quoi
le pH, la force ionique, et la température
Est ce que la valeur maximale de l’activité des enzymes sont tjrs au pH physiologique
Non :
- la valeur maximale de l’activité de certaines enzymes peut être très loin du pH
physiologique
- par exemple, la phosphatase alcaline possède une activité maximale à pH 10-11.
Cependant, son KM est plus bas à pH 7 qu’à pH 10-11; ceci est important afin de
comparer les activités entre les essais avec des conditions différentes
Quel est l’ajout du tampon dans une activité enzymatique ( + donné des exemple + effet d’association faible + effet des tampons sur les ions métalliques )
Certains tampons peuvent agir comme inhibiteurs
* Par exemple, le phosphate et certaines tampons anioniques, possédant des
charges multiples tel que le citrate, compétitionnent avec des substrats
possédant des charges négatives pour lier le site actif
* Puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et
100mM, même une association faible par le tampon peut provoquer une
inhibition importante
* Des ions métalliques, essentiels pour l’activité, peuvent être complexés par
des tampons tels que le citrate et l’imidazole, et compromettre l’activité
enzymatique
Expliquer l’effet de la force ionique sur l’activité enzymatique
La force ionique physiologique se situe entre 0.1 - 0.2M; les enzymes sont
très souvent moins actives à une force ionique inférieure à la valeur
physiologique
Expliquer l’effet de la température sur l’activité enzymatique ( vitesse + l’enzyme elle-même - exception p/r au période d’incubation + quelle t sont alors souvent utilisées )
- La vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 2 pour chaque
augmentation de 10°C - Cependant, à de hautes températures, même si la température augmente la vitesse
d’une enzyme, l’enzyme peut être dénaturée durant l’essai - Plus la période d’incubation est courte, plus la température apparente de l’activité
maximale peut être élevée puisqu’il y a moins de temps pour que l’enzyme se
dénature - La température de référence et celle choisie est très souvent est 25°C mais la
température physiologique 37°C est fréquemment utilisée
La mesure de l’activité d’une enzyme dépend de quelle méthode et cela implique quoi
méthode qui détermine la
quantité de produit généré durant la réaction
Ceci peut impliquer la séparation du produit et du substrat après la réaction.
Nommer les méthodes qu’on peut utiliser pour la mesure de l’activité enzymatique
- des méthodes discontinues (flot arrêté)
- des méthodes continues
Qu’est ce que les méthode discontinue
- L’enzyme est incubé avec ses substrats pendant une certaine période de
temps et la réaction est ensuite arrêtée
Vrai ou faux : les méthodes discontinues peuvent s’appliquer à n’importe quel système enzymatique
Vrai
Expliquer l’importance de l’évolution linéaire et les problèmes associés dans les méthodes discontinues
- Le produit est dosé et son évolution est assumée linéaire pendant la période
de l’incubation - À vérifier
- Problème : procéder à une seule mesure peut sous-estimer la vitesse initiale du fait de la perte de linéarité à
des temps trop longs
Comment remédier à la perte de linéarité ( + donner dans quel cas c’ets important de le faire
Il est essentiel de faire plusieurs incubations à des temps différents afin de vérifier si la réaction est linéaire
- Ceci est très important dans le cas d’ extraits à partir d’une lyse cellulaire à cause
de la possibilité de réactions secondaires:
=>par exemple dans un extrait contenant l’enzyme subséquent dans une
voie métabolique, une autre enzyme consomme le produit qu’on veut mesurer
Vrai ou faux : Il y a des contraintes véritables en ce qui concerne des conditions d’incubation
Faux
Donnez les étapes des méthodes discontinues
’échantillon contenant l’enzyme est ajusté à temps zéro et rapidement mélangé; la
réaction est incubée pendant des temps fixe et ensuite arrêtée.
- la réaction est arrêtée par une méthode qui provoque la dénaturation instantanée
de l’enzyme ou déplace l’équilibre de la réaction afin que l’enzyme ne soit plus
active
- les méthodes souvent utilisées sont la précipitation par acide trichloracétique ou
perchlorique ou par dénaturation thermique de l’enzyme
- on peut également utiliser le SDS pour dénaturer l’enzyme
- la réaction peut être arrêtée également par des méthodes non dénaturantes qui
inactivent l’enzyme
*- i.e. changement de pH, ajout d’EDTA si des ions métalliques sont essentiels,
dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué par un isotope
radioactif est mesuré
La mesure du produit par quelles types de méthode
Méthode enzymatiques
Donnez les manières de mesurer le produit
- une approche utilisée pour les détecter est de convertir le produit directement ou indirectement en un autre produit qui lui est plus facile à détecter
- les techniques de détection utilisées le plus fréquemment sont la spectrophotométrie ou la fluorométrie
Donnez le but des différentes méthodes pour détecter le produit
Le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de
la production d’un chromatophore ou fluorophore important et qui est facile à détecter
Expliquer la détection directe
un des produits de la réaction enzymatique absorbe la
lumière, par exemple, la formation de NADH par
réduction de NAD+ (le NADH absorbe la lumière à 340
nm et émet de la fluorescence à 450 nm)
Expliquer la détection indirecte
- ajoute une enzyme qui utilise le produit de la réaction
pour former du NADH par couplage avec une autre réaction.
Expliquer la méthode par essai couplés
Pour cette approche, il est
essentiel que la réaction couplée
entraîne de façon stœchioméotrique la formation du produit
original (une molécule de P
produit une molécule de R)
la formation d’un produit possédant quoi représente une autre
approche
Chromatophore
Expliquer la chromatographie comme tehcnique pour trouver le produit
Sépare les réactants (substrats et produits) avant qu’ils soient dosés.
Qu’est ce que la mesure de l’activité enzymatique par méthodes continues
- les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observé
pendant toute la réaction et généralement de façon instantanée - il y a un nombre important d’enzymes dont l’activité peut être suivie directement
grâce à la différence en absorbance ou fluorescence entre le produit et le substrat
