Cours 5 : Ultracentrifugation Flashcards
Est ce qu’il y a une sédimentation des macromolécules en solution, qui sont soumises au champ
gravitationnel
non
- l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon
homogène en solution
Comment peut on faire sédimenter les macromolécules
c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à des accélérations énormes qu’elles commencent à sédimenter
L’ultracentrifugation donne quelle vitesse et quelles force
Les vitesses de rotation
de 80,000 rpm (révolutions par minute) qui donnent lieu à des forces dépassent
600,000 X g
a vitesse avec laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de quoi
Sa masse
Qu’a t’on pu démontrer grace à la ultracentrigugeuse
les protéines sont des
macromolécules de composition homogène et qu’un grand nombre de protéines sont
composées de sous-unités
Quelle force s’oppose à la force centrifuge
la force due au déplacement de la solution ( force de flottaison)
le déplacement d’une particule à travers une solution est opposée par quoi
Force de friction
Quelle est la formule de la force de sédimentation et expliquer les éléments
F = mω^2r - Vpρω^2r
m est la masse de la particule
w est la vitesse angulaire
r est le rayon de gyration
Vp est le volume de la particule
ρ est la densité de la solutio
Donné la formule de la force de friction
friction = v f
Sous l’influence d’une force centrifuge, une particule va accélérer jusqu’à quoi et donnez la formule ( on atteint quoi )
toutes les forces soient contrebalancées, soit :
mω^2r - Vpρω^2r = v f
où on atteint la phase stationnaire
À quoi peut servir l’ultracentrifugation
À mesurer la masse de macromolécules
*’il sera possible de déterminer la masse d’une
particule, m=M/N, à partir de son coefficient de sédimentation S et de son
coefficient de friction
la masse des complexes de macromolécules est souvent exprimé avec quel unité
Svedberg
V/F : il y a une relation directe entre la masse moléculaire et le coefficient de sédimentation
Vrai mais il y a des exceptiosn
Expliquer les masses des sous-unité et du complexe du ribosome bactérien
- les sous-unités 30S et 50S sont constitués par
les ARNr 5S, 16S et 23S - les deux sous-unités s’assemblent pour former le
ribosome 70S
Expliquer les masses des sous-unité et du complexe du ribosome eucaryote
- les sous-unités 40S et 60S sont constitués par
les ARNr 5S, 5.8S, 18S et 23S - les deux sous-unités s’assemblent pour former le
ribosome 80S
À quoi sert le complexe du protéasome 26 s
chez les eucaryotes, complexe multiprotéique
impliqué dans la dégradation des protéines
Si on met deux sous-unités ensemble est ce que la masse du complexe en Svedberg est la somme de la masse des sous-unité
NON ca dépend aussi du volume
La centrifugation préparative sont concues pour quoi
pour la préparation d’échantillons possédant des volumes significatifs
La sédimentation est fait dans quel sln ( centrifugation préparative )
dans une solution inerte comme le saccharose ou de chlorure de césium (CsCl) dans lesquels la concentration et donc la densité augmente du haut vers le bas du rotor
L’utilisation de gradients de densité augmente de façon significative quoi et minimise quoi ?
- Augmente Le pouvoir de
résolution de la centrifugeuse. - Minimise Ce type de gradient minimise l’agitation d’une solution par convection
(qui peut nuire à la résolution)
Quel sont les deux application des gradients de densité
1) Ultracentrifugation zonale ou en zones
2) Ultracentrifugation en gradient de densité à l’équilibre
L’ultracentrifugation en zone permet quoi
La séparation des particules selon leurs coefficients de sédimentation
Comment est disposée la solution de macromolécules est déposée ( U en zone )
sous forme de couche en haut d’un gradient de densité préparé au préalable
Quelle substance on utilise pour former le gradient
le saccharose, qui est visqueux et biochimiquement inerte
La vitesse de sédimentation est une fonction plus sensible à la forme d’une macromolécule qu’a sa densité, l’ultracentrifugation en zones sépare les
macromolécules de forme similaire selon quoi
Leur masse
Expliquer se qui se passe pendant la centrifugation ( U en zone )
Pendant la centrifugation, chaque molécule se déplace à travers le gradient à une vitesse largement déterminée par leur coefficient de sédimentation et donc migre comme une zone
Comment est ce qu’on récolte des fractions
la récolte des fractions se fait par l’insertion d’une aiguille au
fond du tube de centrifugation et on collectionne le contenu du tube par un collecteur
de fraction
L’ultracentrifugation par densité d’équilibre est aussi appelé comment, sépare les macromolécules selon quoi
centrifugation
isopycnique, sépare les macromolécules selon leur densité ( permet de séparer des protéines qui ont les mêmes masse )
Que se passe t’il lors de la centrifugation ( c isopycnique )
Le fort champ centrifuge génère un gradient important de sel dans lequel les
composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de densités égales à celle de la
solution de sel. Donc aucune migration puisque v = 0
L’échantillon est dissous dans quoi ( C isopycnique )
une solution concentrée d’une substance dense qui
diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs2SO4, et qui est subie à des hautes vitesses de rotation
Pourquoi choisirais t’on ( c ispycnique )
Technique préférée pour séparer des macromolécules qui possèdent une gamme de
densités.
Donnez des exemple de macromolécules qui possèdent une gamme de densités.
- acides nucléiques (plasmide vs ADN génomique et ARN total)
- ribosomes et polysomes
- virus
- organites subcellulaires (microsome, mitochondries, …
Expliquer les différents type de centrifugueuse **
- Rotor à angle fixe
- Rotor à gobelets mobiles
=> Diapo 12
Expliquer le fonctionnement d’une centrifugeuse
les ultracentrifugeuses crées un vacuum dans la chambre du rotor pour permettre
d’obtenir de très hautes vitesses de centrifugation sans avoir la friction de l’air,
ce qui peut amener un échauffement des échantillons
de plus, la chambre du rotor est réfrigérée pour éviter le réchauffement des
échantillon
Quelle songt le vitesse obtenues avec une centrifugeuse
(de l’ordre de 80 000 à 100 000 rpm)
