Cours 4.1 : Électrophorèse Flashcards
Qu’est ce que l’électrophorèse
La migration d’un ion dans un champ électrique,
=>est utilisée
dans les séparations analytiques des molécules biologiques
Pour qu’une molécule puisse migrer dans un champ électrique, il faut quoi
F électrique > F friction
selon les lois de l’électrostatique, la force électrique, Félectrique, sur un ion avec une charge q dans un champ électrique d’intensité, E, est:
F électrique = q x E
la migration électrophorétique de l’ion à travers la solution est opposée par
une quoi ( expliquer la formule et les éléments de celle-ci )
Force de friction
Ffriction = vf
où v représente la vitesse de migration et f son coefficient de frictio
Le coefficient de friction nous donne quoi + il dépend de quoi
une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration
=>dépend de la taille
- de la forme de l’ion,
- de la viscosité de la solution
La mobilité électrophorique caractérise quoi ( donne l’équation de celle-ci )
Vitesse de chaque ion
mobilité électrophorétique, µ, définie par : µ = v / E = q / f
L’équation de mobilité électrophorétique indique quoi
cette équation indique que les protéines à leur point isoélectrique (où q=0)
possèdent une mobilité électrophorétique nulle
Quelle est la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée ( explique cette méthode )
l’électrophorèse
en zones
- technique dans laquelle l’échantillon est contraint à se déplacer dans
une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose, ou d’un gel
L’électrophorèse en zone permet quoi AVANTAGE
1) on élimine largement l’agitation provoquée par la convection, un facteur
limitant du point de vue résolution.
2) en plus, cette technique requiert une quantité faible de matériel permettant
ainsi la migration des composantes en bandes discrètes.
Qu’est ce que l’électrophorèse sur gel ( comparaison avec d’autres méthode + la séparation moléculaire est basée sur quoi )
- constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à utiliser dans la
séparation des macromolécules - la séparation moléculaire est basée non seulement
sur la mobilité électrophorètique des molécules, mais aussi sur le principe de filtration sur gel
Quels sont les gels commun d’usage
l’agarose et le polyacrylamide, possèdent des pores de
la taille des protéines à séparer
Expliquer le mode d’action des gels d’électrophorèse , c’est dû à quoi ( ca donne quoi )
- les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grande,
(ce qui est l’inverse de la filtration par gel). - ceci est dû au fait que dans la filtration par gel, il y a des espaces pour le
solvant entre les billes de gel, ce qui n’existe pas dans l’électrophorèse sur gel
=> la migration des molécules larges est retardée par rapport aux molécules plus petites
Comment sont fabriqués les gel pour l’électrophorèse en gel de polyacrylamide
Les gels sont fabriqués à partir d’une polymérisation radicalaire d’acrylamide
et N,N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon
Électrophorèse en gel de polyacrylamide est aussi appelé comment
PAGE
Est ce que les gels de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide se forme spontanément
Non => besoin d’un catalysateur ( sulfate )
Expliqué les étapes de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide
1) avant que le mélange réactionnel n’ait
durci, il est coulé dans un récipient formé
par deux plaques de verres et polymérisera
en une couche mince de gel de quelques
millimètres
2) les échantillons sont déposés dans des
puits préformés au sommet du gel
3) le tampon est le même dans les
réservoirs du haut et du bas (pH ~9 pour
que toutes les protéines aient une charge
négative)
4) un courant continu de 100 à 200 volts
parcourt le gel pendant la durée de la
migration
=> les protéines migreront vers l’anode (+)
selon leur ratio charge/masse
=> diapo 6
Expliquer dans le gel polyacrylamide l’impact de la longueur du gel
plus le gel est long,
meilleure est la finesse des bandes et la
résolution
=> permet de séparer les protéines plus finement
Pourquoi utiliser l’électrophorèse en pH discontinu
afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes
plus minces,
Le gel peut être modifié en utilisant deux gels dans des tampons différent, Quels sont les gels
A- un gel de séparation (running gel), préparé comme le gel précédent
B- un gel de concentration (stacking gel), qui surmonte le gel de séparation et qui est
de plus haute porosité
Expliquer les différent tampon présent dans les réservoir ( Électrophorèse en pH discontinu)
- le tampon dans le réservoir du bas et celui du gel de séparation sont identiques
- le tampon du gel de concentration possède un pH ~ 2 unités de moins.
- le pH du tampon dans le réservoir supérieur doit contenir un acide faible (typiquement de la glycine,
pKa = 9.78) et son pH est ajusté près de celui du réservoir inférieur
Expliquer l’activité dans le gel ( concentration )supérieur du réservoir (Électrophorèse en pH discontinu)
- pH 6.8: la Glycine est de charge neutre
- augmente la résistance au courant électrique
- selon la loi de Ohm (E = IR), une résistance R plus élevée, à
avec un courant I constant résulte en une augmentation du champ
électrique E - ↑ de la vitesse de migration des protéines
Expliquer l’activité lors du passage entre les deux gels (Électrophorèse en pH discontinu)
- le passage d’un gel de 5% à un gel de 10% acrylamide ralenti la
migration électrophorétique à la jonction des deux gels - compaction des protéines en fines bandes
Expliquer expliquer l’activité dans le gel de séparation ( inférieur ) (Électrophorèse en pH discontinu)
- pH 8.8: la Glycine devient chargée négativement
- la résistance électrique R diminue
- diminution du champ électrique E
- ↓ de la vitesse de migration des protéines
- séparation des protéines en fonction du ratio
charge/masse
Quand les protéines entrent dans le gel de séparation, elles sont retardées selon quoi
leurs tailles par l’effet de filtration du gel:
- petites protéines migrent plus rapidement
- grosses protéines migrent plus lentement
la réduction dans les bandes macromoléculaires en rentrant dans le gel de séparation augmente quoi
La résolution du point de vue de la séparation des macromolécules
Quelle est la méthode la plus répandue parmi les techniques biochimiques afin de déterminer la
pureté d’une protéine
Gels SDS-PAGE
La technique du Gels SDS-PAGE dépend de quoi
du fait que certains savons ou détergents, par le biais de
leurs interactions hydrophobes, sont capables de dénaturer la structure d’une protéine
Quel est l’un des détergents les plus puissants pour dénatuere la protéine
le sodium dodecyl sulfate (SDS)
Expliquer comment le SDS dénature les protéines
- le SDS se lie de façon importante aux protéines; une concentration de 0.1%
dodecyl sulfate est suffisante pour saturer par sa liaison avec une chaîne
polypeptide à un taux de 1 molécule de détergent par 2 résidus d’acides aminés - en présence de SDS, les protéines contenant des sous-unités sont désunies et la
chaîne polypeptide de chaque sous-unité adopte une conformation étendue
Quel est l’impact du SDS sur la charge des protéines => quel est la conséquence de ce changement
- la forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge
intrinsèque des protéines - par conséquence le rapport charge/masse sera le même pour toutes les protéines
de même masse
=> la séparation électrophorétique du gel avec du SDS dépendra uniquement du phénomène de gel-filtration par les pores du gel
Donné une caractéristiques des bandes récupérer grace au gel SDS-PAGE
Les bandes sont les plus résolues de toutes les méthodes d’analyse ( meilleures résolution )
Quel est l’avantage du Gel SDS-PAGE p/r à L’électrophorèse ordinaire
1) l’utilisation de SDS dissous les agrégats et les particules insolubles qui
peuvent causer des problèmes en bloquant les pores du gel
2) la mobilité électrophorétique possède une relation directe avec le poids
moléculaire
Expliquer la relation graphique entre les masses moléculaires des
protéines et leur mobilité électrophorétique
- en utilisant des marqueurs de poids moléculaires connus, il est possible de calibrer la migration sur gel par rapport
aux poids moléculaires
=>on peut obtenir une relation linéaire entre la mobilité électrophorétique et le logarithme du poid moléculaire
Comparé le gal PAGE vs SDS PAGE
PAGE :
Résolution :
- faible
(dépend de la
longueur du gel)
Migration :
- ratio ( charge masse )
Dénaturation des complexe protéique :
- non
Dénaturation des agrégats protéiques :
- non
SDS-PAGE
Résolution :
-excellente
Migration :
- linéaire avec le logarithme
de la masse moléculaire
des protéines
Dénaturation des complexe protéique :
- oui
Dénaturation des agrégats protéiques :
- oui
Résumé l’électrophorèse avec un gel SDS PAGE
=> Diapo 15
1) Protéine à l’état native
2) Dénaturée et entouré par le SDS-PAGE
3)migre dans le gel selon leur taille
4) Colore le gel
=>Chaque bande correspond à des protéine de masse moléculaire différente ( masse moléculaire plus basse en bas )
5) Étalonnage : graphique et relation linéaire
Quelles sont les différentes approches pour visualiser les protéines + Quel sont le problème avec ces approches
- la coloration avec le bleu de Coomassie brillant (Figure 7A)
- la coloration au nitrate d’argent (Figure 7B)
- autoradiographie (si les protéines sont marquées avec un isotope
radioactif comme le S35 ou le C14)
=> ces approches vont cependant détecter toutes les protéines sur le gel ( pas spécifique )
Nommez une approche plus spécifique pour trouver une protéine d’intérêt , cette approche consiste en quoi
Immunobuvardage ou “Western blot”
=>consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un
anticorps qui reconnaît cette protéine
