Cours 5 - Détermination de structure par cristallographie Flashcards
1
Q
Quelle est la suite d’étapes permettant de déterminer la structure d’une macromolécule biologique par cristallographie ? (3)
A
→ (1) Un faisceau de rayons X est dirigé sur un cristal,
→ (2) le cristal diffracte le faisceau, ce qui produit un diagramme de diffraction,
→ (3) l’analyse de ce diagramme permet de reconstituer la structure tridimensionnelle de la macromolécule avec une résolution quasi-atomique.
2
Q
Quelles sont les étapes de la détermination de structure par cristallographie ? (6)
A
→ 1. Purification de la protéine
→ 2. Préparation d’un cristal bien ordonné
→ 3. Collection des spectres de diffraction
→ 4. Détermination des phases
→ 5. Construction du modèle préliminaire
→ 6. Affinement du modèle préliminaire et validation
3
Q
Quel niveau de pureté doit avoir une protéine pour être utilisée en cristallographie ? Pourquoi?
A
→ Une pureté d’environ 98 %.
→ Pour favoriser la formation de cristaux bien ordonnés.
4
Q
Quel est l’objectif principal de la filtration sur gel dans la purification des protéines ?
A
→ Se débarrasser des protéines agrégées.
5
Q
Que permet également la filtration sur gel, en plus de la purification ?
A
→ De changer de tampon.
6
Q
Pourquoi la préparation d’un cristal bien ordonné est-elle considérée comme une étape très importante ?
A
→ Parce qu’elle conditionne la qualité des données de diffraction et donc du modèle final.
7
Q
Quel type de protéines pose souvent problème à la cristallisation ?
A
Les protéines globulaires → À cause de leur surface désordonnée.
8
Q
Que se passe-t-il lorsque les protéines interagissent entre elles dans des conditions favorables ? (Cristallisation)
A
→ Elles créent un réseau ordonné et périodique.
9
Q
Quel est le lien entre la formation d’un réseau ordonné et la diffraction des rayons X ?
A
→ Seul un réseau ordonné permet de produire un motif de diffraction interprétable.
10
Q
Qu’est-ce qu’une unité élémentaire (ou maille) dans un cristal ?
A
→ C’est la plus petite unité qui peut être répétée par translation dans toutes les directions de l’espace.
11
Q
Combien de molécules de la protéine d’intérêt peut contenir un cristal de 100 μm de côté ?
A
→ Environ 10¹⁵ molécules.
12
Q
Vrai ou faux : Un cristal est formé à partir de plusieurs types de protéines pour assurer sa stabilité.
A
→ Faux, un cristal contient typiquement une seule protéine d’intérêt.
13
Q
Quelle est l’étape la plus longue et incertaine du processus de cristallographie ?
A
→ L’obtention des cristaux.
14
Q
Vrai ou faux : La formation de cristaux est un processus simple et rapide.
A
→ Faux. C’est une étape difficile, plus longue et incertaine du processus.
15
Q
Donne trois paramètres pouvant influencer la formation des cristaux. (3)
A
→ La concentration en sel,
→ La présence d’ions,
→ La présence de liquide.
16
Q
Vrai ou faux : La formation de cristaux est un processus simple et prévisible.
A
→ Faux, elle dépend d’un grand nombre de paramètres.
17
Q
Quelle est la technique de cristallisation la plus facile à mettre en œuvre ?
A
→ La cristallisation par batch.
18
Q
Quelle est la technique de cristallisation la plus efficace pour les protéines ?
A
→ La cristallisation par diffusion de vapeur.
19
Q
En quoi consiste la cristallisation par batch ?
A
→ Elle consiste à mélanger la protéine avec une grande quantité de solution mère contenant les ingrédients nécessaires à la cristallisation.
20
Q
Que contient la solution mère utilisée dans la cristallisation par batch ?
A
→ Les ingrédients nécessaires à la cristallisation.
21
Q
Dans quel domaine la cristallisation par batch est-elle principalement utilisée ?
A
→ Surtout en chimie organique.
22
Q
En quoi consiste la cristallisation par diffusion de vapeur en méthode de goutte pendante ?
A
→ À déposer une petite quantité de protéine sur une lamelle de verre.
23
Q
Que faut-il ajouter à la goutte de protéine lors de la cristallisation par goutte pendante ?
A
→ Une quantité équivalente de solution mère.
24
Q
Pourquoi ajoute-t-on de la solution mère à la goutte de protéine ?
A
→ Pour fournir les conditions nécessaires à la cristallisation.
25
Que se passe-t-il après l’ajout de la solution mère à la goutte de protéine ?
→ La solution de protéine se mélange avec la solution mère.
26
Où est placée la lamelle contenant la goutte de mélange protéique dans la méthode de goutte pendante ?
→ Elle est scellée sur le dessus d’un puits contenant une grande quantité de solution mère.
27
Pourquoi scelle-t-on la lamelle sur le puits ?
→ Pour créer un environnement fermé favorisant l’échange de vapeur entre la goutte et la solution mère.
28
Que se passe-t-il après la fermeture du puits dans la méthode de goutte pendante ?
→ Il y a une équilibration entre la goutte pendante et la solution mère.
29
Quel est le principal effet de l’équilibration sur la goutte pendante ?
→ La goutte se concentre en protéines et en solutés.
30
Quelle substance diffuse principalement de la goutte vers la solution mère ?
→ L’eau (H₂O).
31
Vrai ou faux : Pendant l’équilibration, la concentration en protéine et en solutés dans la goutte diminue.
→ Faux, elle augmente.
32
Que font les protéines en solution après l’équilibration ?
→ Elles interagissent entre elles pour former des noyaux.
33
Que deviennent les noyaux formés par les protéines ?
→ Ils grandissent pour donner naissance à des cristaux.
34
Quelle est la condition clé pour que les protéines forment des cristaux au lieu de précipiter ?
→ Une bonne interaction contrôlée entre les protéines sans précipitation ni agrégation.
35
Vrai ou faux : La formation de cristaux commence par une agrégation non spécifique des protéines.
→ Faux, elle commence par la formation de noyaux ordonnés.
36
Quel est le risque si les protéines précipitent trop rapidement ?
→ Elles s’agrègent au lieu de former des cristaux.
37
Que représente l’axe vertical dans le diagramme de phases ?
→ La concentration de protéine.
38
Que représente l’axe horizontal dans le diagramme de phases ?
→ La concentration en agent précipitant.
39
Quelle zone du diagramme est favorable à la formation de cristaux ?
→ La zone de nucléation.
40
Pourquoi faut-il éviter la zone de précipitation dans le diagramme de phases ?
→ Parce qu’elle mène à la précipitation non contrôlée des protéines, ce qui empêche la formation de cristaux.
41
Que se passe-t-il dans la zone métastable ?
→ Les cristaux peuvent croître lentement sans nouvelle nucléation.
42
Vrai ou faux : Aller trop rapidement vers la courbe de supersaturation favorise la cristallisation.
→ Faux, cela peut provoquer une précipitation au lieu d’une cristallisation contrôlée.
43
Que faut-il faire pour favoriser la cristallisation selon le diagramme de phases ?
→ Il faut atteindre lentement la zone de nucléation pour permettre la formation de cristaux.
44
Quelle est la différence entre la courbe de solubilité et la courbe de supersaturation ?
→ La courbe de solubilité sépare la sous-saturation de la zone métastable,
→ Tandis que la courbe de supersaturation sépare la zone métastable de la zone de précipitation.
45
Quels paramètres du tampon peuvent influencer la cristallisation ?
→ Sa nature, sa concentration et son pH.
46
Donne un exemple d’agent précipitant couramment utilisé.
→ Le polyéthylène glycol.
47
Quels ions peuvent influencer la cristallisation ? (3)
→ Le sodium, le potassium ou encore le bromure.
48
Quelle est l’importance de la nature du solvant dans la cristallisation ?
→ Elle peut affecter la solubilité et l’interaction des protéines (ex : solvant aqueux vs méthanol, éthanol).
49
Vrai ou faux : Les ligands n’ont aucun impact sur la cristallisation.
→ Faux, leur présence peut favoriser ou inhiber la formation de cristaux.
50
Quel est l’effet de la température sur la cristallisation ?
→ Elle peut influencer la vitesse de formation des cristaux et leur qualité.
51
En quoi la concentration de la protéine est-elle cruciale pour la cristallisation ?
→ Elle doit être suffisante pour atteindre la zone de nucléation, mais pas trop élevée pour éviter la précipitation.
52
Que signifie modifier la protéine pour la cristallisation ?
→ Utiliser des variantes par mutagenèse ou des homologues pour améliorer les chances de formation de cristaux.
53
Pourquoi la robotisation est-elle particulièrement utile dans la cristallisation des protéines ?
→ Parce qu’elle permet de tester simultanément de nombreuses combinaisons de paramètres expérimentaux.
54
Quelle est la première étape pour obtenir des cristaux de protéines ?
→ Le criblage de conditions à partir de la protéine.
55
Qu’appelle-t-on un « hit » dans le processus de cristallisation ?
→ L’apparition de mini cristaux lors du criblage.
56
Que se passe-t-il après l’obtention d’un « hit » ?
→ On procède à l’optimisation pour obtenir de meilleurs cristaux.
57
Quelle est l’étape qui suit la formation de cristaux optimisés ?
→ L’exposition aux rayons X pour obtenir un patron de diffraction.
58
À quelle échelle de longueur d’onde se situent les interactions qui nous intéressent en cristallographie ?
→ À l’échelle de l’ångström, soit 10⁻¹⁰ mètres (un dixième de nanomètre).
59
À quel domaine du spectre électromagnétique appartiennent les rayons utilisés en cristallographie ?
→ Aux rayons X.
60
Pourquoi utilise-t-on des rayons X en cristallographie ?
→ Parce que leur longueur d’onde est comparable à celle des distances interatomiques.
61
Quelle est la différence entre un générateur de rayons X et un synchrotron ?
→ Le générateur de rayons X produit des rayons X monochromatiques (1,54 Å) avec une faible intensité. Il est peu sensible.
→ Le synchrotron émet des rayons X polychromatiques (0,5–2,5 Å) avec une forte intensité.
62
Que se passe-t-il lorsque le faisceau primaire de rayons X frappe le cristal ?
→ La majorité du rayonnement passe à travers, mais une partie est diffractée par le cristal.
63
Que devient le rayonnement diffracté par le cristal ?
→ Il est enregistré par un détecteur.
64
Que fait-on avec les signaux détectés ?
→ Les signaux reçus sont transmis à un ordinateur.
→ Capturer les faisceaux diffractés pour permettre leur analyse informatique.
65
Pourquoi doit-on faire tourner le cristal durant l’expérience de diffraction ?
→ Pour obtenir un jeu de données complet sous différents angles.
66
Vrai ou faux : Tout le faisceau de rayons X est absorbé par le cristal.
→ Faux, seule une partie est diffractée, la majorité passe à travers.
67
Que représente l’espacement entre les taches dans un patron de diffraction ?
→ Il donne une information sur la taille de l’unité élémentaire du cristal.
68
Que permet de déterminer l’intensité des taches sur un patron de diffraction ?
→ Elle donne des informations sur la structure des protéines.
69
Comment est liée la résolution à la distance des taches par rapport au centre ?
→ Elle est inversement proportionnelle : plus la tache est éloignée du centre, plus la résolution est faible.
70
Que signifie une résolution élevée dans un patron de diffraction ?
→ Une meilleure organisation cristalline et plus de détails dans la structure.
71
Vrai ou faux : Plus les taches sont proches du centre, plus la résolution est faible.
→ Faux, plus elles sont proches du centre, plus la résolution est élevée.
72
Quelle est la conséquence de l'interaction entre rayons X et électrons, lorsqu'ils frappent la matière ?
→ Une dispersion du faisceau lumineux.
73
Que se passe-t-il lorsqu’un rayon X frappe un seul atome ?
→ Il provoque une dispersion diffuse des rayons (en théorie).
74
Comment appelle-t-on les rayons X avant qu’ils interagissent avec l’atome ?
→ Les rayons X incidents.
75
Quel rôle joue le nombre d’électrons dans la diffraction des rayons X ?
→ Plus un atome a d’électrons, plus il peut interagir et dévier les rayons X.
76
Comment Bragg décrit-il la diffraction des rayons X par un cristal ?
→ Comme une réflexion du faisceau incident par une série de plans parallèles, comme des miroirs.
77
Que doivent parcourir les rayons réfléchis pour produire une diffraction constructive ?
→ Une distance égale à un multiple de la longueur d’onde du rayonnement.
78
Quel outil mathématique est utilisé pour interpréter les taches de diffraction en termes de positions atomiques ?
→ La transformée de Fourier.
79
Quelle est la deuxième difficulté majeure après la cristallisation dans une analyse par cristallographie ?
→ La détermination des phases et construction du modèle préliminaire.
80
Quelles deux informations sont nécessaires pour construire une carte de densité électronique à partir des données de diffraction ?
→ L’intensité et les phases des rayons X diffractés.
81
Quelle opération mathématique permet de passer des intensités et phases à une carte de densité électronique ?
→ La transformée de Fourier.
82
Et pour passer d’une carte de densité électronique aux données de diffraction ?
→ On utilise la transformée inverse de Fourier.
83
Quels sont les trois paramètres qui définissent les ondes des faisceaux diffractés ?
→ L’amplitude, la longueur d’onde et la phase.
84
Qu’est-ce que l’amplitude représente dans le contexte des rayons X diffractés ?
→ L’amplitude est mesurée par l’intensité du rayonnement diffracté.
Et → Elle est proportionnelle à l’intensité de la tache.
85
Quel paramètre est perdu lors de l’expérience de diffraction et constitue un problème majeur ?
→ La phase.
86
Vrai ou faux : La longueur d’onde est une donnée variable pendant une expérience de diffraction.
→ Faux, elle est fixée par la source.
87
Que faut-il combiner pour obtenir l’image d’un modèle après transformation inverse de Fourier ?
→ Les intensités et les phases.
88
En quoi consiste la méthode directe pour résoudre le problème des phases ?
→ La méthode directe consiste à calculer un patron théorique pour chacune des positions des atomes et à le comparer avec celui obtenu expérimentalement.
89
Quelle est la limitation principale de la méthode directe ?
→ Cette technique n’est utilisable que pour des petites molécules.
90
Qu’est-ce que le replacement isomorphe ?
→ C’est le fait de tremper les cristaux dans une solution d’atomes lourds (plus d’électrons comme Hg, Pb, U…).
91
À quoi se lient les métaux dans la protéine lors du replacement isomorphe ?
→ Les métaux se lient à des acides aminés spécifiques, souvent Cys et His.
92
Pourquoi utilise-t-on des atomes lourds pour le replacement isomorphe ?
→ Parce qu’ils ont plus d’électrons, donc une plus grande dispersion des rayons X.
93
Comment obtient-on le patron de diffraction de l’atome lourd seul ?
→ En soustrayant le patron de diffraction du cristal non trempé à celui du cristal trempé.
94
Comment les phases sont-elles obtenues après un replacement isomorphe ?
→ Elles sont ensuite obtenues par méthode directe.
95
En quoi consiste la dispersion anomale ?
→ Elle consiste à remplacer un atome de la protéine par un atome lourd (ex : remplacement de la méthionine par la sélénométhionine).
96
Que se passe-t-il à une certaine longueur d’onde lors de la dispersion anomale ?
→ L’atome lourd entre en résonance, ce qui modifie ses propriétés de diffraction.
97
Comment obtient-on le patron de diffraction spécifique de l’atome lourd ?
→ En soustrayant les patrons de diffraction à la longueur d’onde de résonance de ceux collectés à une autre longueur d’onde.
98
En quoi consiste le remplacement moléculaire en cristallographie ?
→ Il consiste à utiliser un homologue de la protéine dont la structure est déjà connue et disponible dans la PDB (Protein Data Bank).
99
Quelles données sont utilisées lors du remplacement moléculaire ?
→ On utilise les intensités observées dans les patrons de diffraction de la structure inconnue, et les phases calculées à partir de la structure connue.
100
Qu’est-ce qu’une carte de densité électronique ?
→ Une carte de densité électronique est une carte de probabilité pour les électrons à chaque position x/y/z dans l’unité élémentaire.
101
Quel est le rôle des logiciels spécialisés dans l’interprétation des cartes de densité électronique ?
→ Ils automatisent l’interprétation en traçant la structure atomique à partir de la carte.
102
Pourquoi une intervention humaine est-elle toujours nécessaire après l’utilisation des logiciels ?
→ Pour s’assurer de la fidélité du résultat généré par le logiciel.
103
Quelle est la première étape de la construction du modèle en cristallographie ?
→ Calculer les cartes de densité électroniques avec les phases extraites d’un modèle d’homologie ou de méthodes expérimentales.
104
Pourquoi cette construction est-elle un processus itératif ? (Construction du modèle en cristallographie)
→ Parce que de nouveaux détails apparaissent après chaque cycle, ce qui permet d’améliorer les phases et le modèle.
105
Que permet l’affinement cristallographique lorsqu’un cristal diffracte à haute résolution (< 2,5 Å) ?
→ Il permet d’éliminer la plupart des erreurs du modèle.
106
Quel est l’objectif principal de l’affinement du modèle à l’aide de logiciels ?
→ Diminuer le facteur R.
107
Que représente le facteur R en cristallographie ?
→ La différence entre les amplitudes de diffraction expérimentales et les amplitudes calculées à partir du modèle.
108
Quelle est la plage de valeurs du facteur R pour une structure protéique bien déterminée ?
→ Généralement entre 0,15 et 0,20.
109
Vrai ou faux : Un facteur R de 0,59 indique une structure très bien déterminée.
→ Faux. 0,59 indique un désaccord total.
110
Quelles sont les origines possibles d’un facteur R imparfait ?
→ Conformation variable de la protéine, imprécisions liées au solvant, orientation différente des microcristaux, ou erreurs dans la construction du modèle.
111
Quel type de carte est obtenu à partir des intensités observées et des phases calculées ?
→ La carte Fo.
112
À partir de quelles données sont calculées les cartes de densité électroniques ?
→ À partir des intensités expérimentales et des phases issues du modèle.
113
Que représente la carte Fo en cristallographie ?
→ Elle est obtenue avec les intensités observées et les phases calculées à partir du modèle ; c’est une carte biaisée par le modèle.
114
Que permet d’obtenir la carte Fo–Fc ?
→ Elle met en évidence les différences entre les intensités observées et calculées, ce qui aide à localiser les erreurs du modèle.
115
Quelle carte combine les informations de Fo et Fo–Fc pour réduire le biais ?
→ La carte 2Fo–Fc, qui présente moins de biais dû au modèle.
116
Vrai ou faux : La carte Fo est plus fiable que la carte 2Fo–Fc pour évaluer la précision du modèle.
→ Faux. La carte 2Fo–Fc est plus fiable, car elle réduit le biais introduit par le modèle.
117
Que peut-on observer à basse résolution (5,0 Å) ?
→ On peut uniquement déduire la forme générale de l’hélice.
118
Que permet une moyenne résolution (3,0 Å) ?
→ Elle permet de dessiner le trajet de la chaîne peptidique et de reconnaître certains types de chaînes latérales.
119
Que peut-on distinguer à haute résolution (1,5 Å) ?
→ On peut mieux définir les chaînes latérales, individualiser les atomes, identifier les molécules d’eau et les ions métalliques.
120
Que permet une très haute résolution (1,0 Å) ?
→ Elle permet de distinguer certains atomes (OH, NH₂, CH₃), de mieux voir les liaisons hydrogène, les états de protonation, la dynamique moléculaire et la position des molécules d’eau.
121
À quoi sert le diagramme de Ramachandran ?
→ Il permet d’analyser la conformation du squelette des protéines en représentant les valeurs des angles dièdres φ (phi) et ψ (psi) pour chaque acide aminé.
122
Combien de zones favorables sont présentes dans un diagramme de Ramachandran et à quoi correspondent-elles ?
→ Il y a 3 zones favorables, correspondant aux structures secondaires : hélices α, feuillets β, et hélices gauches.
123
Quelle est la condition de qualité d’un bon ensemble de structures selon le diagramme de Ramachandran ?
→ Au minimum 90 % des acides aminés doivent se trouver dans les zones favorables (en rouge et jaune).
124
Que permettent les patrons de diffraction à haute résolution ?
→ D’obtenir des structures avec des détails très précis.
125
Quels éléments peut-on localiser avec une bonne résolution ?
→ Les molécules d’eau et les ions.
126
Est-il possible d’étudier des protéines de toute taille ?
→ Oui, on peut étudier des protéines seules ou sous forme de complexes moléculaires.
127
Que peut-on faire diffuser dans les cristaux pour résoudre la structure du complexe ?
→ Des petites molécules.
128
Quelle quantité de protéine est requise pour mener une cristallographie aux rayons X ?
→ Une grande quantité de protéine doit être purifiée.
129
Quel type de cristaux est indispensable pour réussir une analyse par diffraction des rayons X ?
→ Des cristaux parfaitement ordonnés (tout-ou-rien).
130
Vrai ou Faux : Les régions très flexibles des protéines sont bien visualisées par cristallographie.
→ Faux. Elles sont rarement visibles.
131
Pourquoi est-il difficile d’obtenir des cristaux adaptés à la cristallographie pour certaines protéines ?
→ Car les protéines ayant des segments dynamiques ont du mal à former des cristaux qui diffractent à haute résolution.
132
Quelle est une conséquence possible des contacts cristallins dans les structures obtenues ?
→ Ils peuvent être la source d’artefacts.
133
Les atomes d’hydrogène sont-ils bien détectés par diffraction des rayons X ?
→ Non, ils sont rarement visibles.
