Cours 2 - Interactions Flashcards
(130 cards)
1
Q
Comment s’exprime la liaison d’un ligand X à un seul site d’une macromolécule M ?
A
→ Elle s’exprime par l’équation d’équilibre : M+X↔MX.
2
Q
Que représentent les termes M et X dans l’équation d’équilibre de liaison ?
A
→ M est la concentration de la forme libre de la macromolécule et X est la concentration de la forme libre du ligand.
3
Q
Quelle est l’expression mathématique de la constante d’association (𝐾𝐴) pour une liaison ligand-macromolécule ?
A
→ 𝐾𝐴=[𝑀𝑋] / [𝑀]*[𝑋]
4
Q
Comment est définie la constante de dissociation (𝐾𝐷) ?
A
→ 𝐾𝐷=1/𝐾𝐴 = [M]*[X] / [MX]
5
Q
Quelle formule utilise-t-on pour estimer le pourcentage de macromolécule liée ?
A
→ %M lié = [MX] / [M]+[MX] ×100%
6
Q
Quelle formule utilise-t-on pour estimer le pourcentage de ligand lié ?
A
→ %X lié = [MX] / [X]+[MX] ×100%
7
Q
Quels types de conditions du milieu cellulaire influencent la formation des complexes ?
A
→ Les conditions physico-chimiques : densité macromoléculaire, sels, pH, températures.
8
Q
Pourquoi le bon repliement des macromolécules est-il important pour la formation de complexes ?
A
→ Il est essentiel pour que les macromolécules puissent interagir correctement avec leurs partenaires.
9
Q
Quel rôle joue la compartimentalisation cellulaire dans la formation de complexes ?
A
→ Elle influence l’accessibilité des macromolécules et de leurs ligands.
10
Q
Donne deux exemples de modifications covalentes pouvant affecter les macromolécules.
A
→ Phosphorylation et acétylation (aussi acceptés : ubiquitination, édition, uridylation, polyadénylation).
11
Q
Quel est le rôle des cofacteurs dans la formation de complexes ?
A
→ Ils sont impliqués dans la liaison ou dans l’activité des macromolécules.
12
Q
Quelles méthodes permettent d’étudier les interactions protéine-protéine ?
A
→ Co-immunoprécipitation,
→ Essai de marquage par proximité,
→ Méthode du double-hybride,
→ Méthode de complémentation des protéines.
13
Q
Quelle méthode est utilisée pour analyser les interactions ADN/protéine ?
A
→ La méthode ChIP (Chromatin Immunoprecipitation).
14
Q
Quelle méthode permet d’identifier les interactions ARN-protéine ?
A
→ La méthode CLIP (Cross-Linking and Immunoprecipitation).
15
Q
Quelle est la première étape du protocole de co-immunoprécipitation ?
A
→ Lyse cellulaire avec un détergent.
16
Q
Quel outil est utilisé pour sélectionner une protéine spécifique ?
A
→ Un anticorps attaché à un support solide.
17
Q
Comment fonctionne la co-immunoprécipitation pour détecter une interaction entre deux protéines ?
A
→ 1. Lyse cellulaire : on utilise un détergent pour libérer les protéines.
→ 2. Sélection : on utilise un anticorps spécifique fixé à un support solide pour capter une protéine connue (ex. : protéine A).
→ 3. Précipitation : si une autre protéine (ex. : protéine B) est liée à A, elle sera co-précipitée avec elle, indiquant une interaction.
18
Q
Quel est le rôle du SDS dans l’électrophorèse sur gel d’acrylamide ?
A
→ Le SDS dénature les protéines et leur confère une charge négative uniforme.
19
Q
Pourquoi ajoute-t-on du β-mercaptoéthanol avant l’électrophorèse ?
A
→ Pour réduire les ponts disulfures et séparer les sous-unités des protéines.
20
Q
De quoi dépend la vitesse de migration d’une protéine dans un gel de polyacrylamide ?
A
→ De la taille (masse moléculaire) de la protéine.
21
Q
Quel est le but du transfert dans le Western blot ?
A
→ Transférer les protéines séparées sur un gel SDS-PAGE vers une membrane poreuse.
22
Q
Quel est le rôle de l’anticorps primaire (Ab₁) dans un Western blot ?
A
→ L’anticorps primaire se lie spécifiquement à la protéine d’intérêt sur la membrane.
23
Q
Pourquoi utilise-t-on un anticorps secondaire (Ab₂) dans le Western blot ?
A
→ L’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme et permet de détecter l’anticorps primaire par réaction colorimétrique.
24
Q
Que se passe-t-il après l’ajout du substrat dans un Western blot ?
A
→ Une réaction enzymatique produit un signal coloré ou lumineux qui permet de visualiser la protéine ciblée.
25
Comment fonctionne la co-immunoprécipitation ?
→ Elle fonctionne par sélection d’une protéine connue à l’aide d’un anticorps, et ses partenaires d’interaction sont aussi co-sélectionnés.
26
Quel est le rôle du Western blot dans une co-immunoprécipitation ?
→ Il permet de détecter les protéines spécifiques parmi les partenaires d'interaction sélectionnés.
27
Vrai ou Faux : La co-immunoprécipitation permet de prouver qu'une interaction est directe.
→ Faux.
28
Pourquoi la co-immunoprécipitation ne peut-elle pas distinguer entre interaction directe et interaction indirecte ?
→ Car elle ne donne pas d’information sur la compétition ou la médiation de l’interaction par d’autres molécules.
29
Quelles sont les trois conditions nécessaires pour démontrer une interaction par co-IP avec Western blot ?
→ Avoir une hypothèse sur l’identité de A et B ;
→ Posséder des anticorps anti-A et anti-B qui n’interfèrent pas avec l’interaction ;
→ Que l’interaction soit stable en présence du détergent utilisé pour la lyse cellulaire.
30
Pourquoi est-il important que l’épitote soit disponible lors de la co-immunoprécipitation ?
→ Car sinon l’anticorps ne pourra pas reconnaître et lier la protéine cible.
31
Quel est l'avantage principal de la co-immunoprécipitation ?
→ Elle peut démontrer des interactions entre protéines endogènes, dans leur contexte cellulaire naturel.
32
Quel est un risque majeur lié à l’utilisation d’un détergent pour la lyse cellulaire dans une expérience de co-IP ?
→ La destruction de certaines interactions et la création de faux positifs.
33
Citez deux inconvénients de la co-immunoprécipitation.
→ La génération d'anticorps spécifiques est fastidieuse/dispendieuse et
→ On ne peut pas affirmer que l’interaction soit directe.
34
Quel est l'un des inconvénients majeurs de la co-IP concernant la protéine cible ?
→ La difficulté de générer un anticorps spécifique pour la protéine cible.
35
Quelle solution permet de contourner ce problème d’anticorps spécifique ?
→ Créer des protéines fusion avec une étiquette attachée (exemples : GST, FLAG-tag, TAP-tag).
36
Où peut-on attacher une étiquette sur une protéine fusionnée ?
→ En position N-terminale ou C-terminale.
37
Donne deux avantages de l’utilisation d’étiquettes sur les protéines.
→ La même étiquette peut être réutilisée (même anticorps ou ligand) ;
→ L’ajout de deux étiquettes (TAP-tag) permet une double purification, réduisant les faux positifs.
38
Quels sont deux inconvénients liés à l’utilisation d’étiquettes sur les protéines ?
→ L’étiquette peut masquer un site de liaison (faux négatifs) ou créer un nouveau site artificiel (faux positifs) ;
→ Expression à partir de vecteurs d’expression qui peut ne pas refléter les niveaux endogènes.
39
Quel est l'inconvénient majeur mentionné concernant la détection après co-immunoprécipitation ?
→ La détection de la protéine co-immunoprécipitée par un autre anticorps.
40
Par quelles méthodes peut-on détecter une protéine co-immunoprécipitée selon l'illustration du slide ?
→ Par fluorescence ou par chimiluminescence.
41
Vrai ou Faux : La méthode de co-immunoprécipitation combinée à la spectrométrie de masse peut être utilisée pour un criblage à haut débit.
→ Vrai.
42
Quelle technique est utilisée pour séquencer de petits peptides (10-20 acides aminés) ?
→ La spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
43
Quel est l’avantage principal de la spectrométrie de masse ?
→ Elle permet le séquençage de petits peptides.
44
Que se passe-t-il après la digestion du gel SDS-PAGE par la trypsine ?
→ L'analyse est faite par chromatographie liquide suivie de spectrométrie de masse en tandem (LC MS/MS).
45
Vrai ou Faux : La séquence des fragments est comparée à des bases de données pour identifier les protéines co-immunoprécipitées.
→ Vrai.
46
Pourquoi l'identification de protéines par spectrométrie de masse peut-elle générer des faux positifs ?
→ Parce que l’identification à partir de banques de données est complexe.
47
Quels sont les avantages de la détection des protéines co-immunoprécipitées par spectrométrie de masse ? (2)
→ Elle permet un criblage rapide et à haut débit des protéines d’interaction
→ L’utilisation de banques de données pour identifier les gènes associés aux peptides, si le génome est séquencé.
48
Quels sont les inconvénients de la détection par spectrométrie de masse ? (4)
→ Il existe des risques de faux positifs (due à la complexité des banques de données),
→ Certains peptides hydrophobes ne sont pas détectés,
→ Les expériences doivent être répétées pour assurer la reproductibilité,
→ Le traitement de la grande quantité de données peut être difficile.
49
Qu’est-ce que la méthode ChIP permet d’identifier ?
→ Elle permet d’identifier les interactions ADN-protéines.
50
Que retrouve-t-on comme résultat d’un ChIP ?
→ Des fragments d’ADN enrichis liés à une protéine particulière.
51
Quelle méthode est utilisée pour déterminer l’identité des fragments d’ADN obtenus par ChIP ?
→ Le séquençage ChIP-seq, une méthode de séquençage à haut débit.
52
Pourquoi utilise-t-on un séquençage à haut débit après un ChIP ?
→ Pour identifier toutes les séquences d’ADN qui ont précipité avec la protéine d’intérêt.
53
Quelle est la fonction principale de la méthode RIP ?
→ Isoler des complexes ribonucléoprotéiques par immunoprécipitation avec crosslink chimique.
54
Quelle est la différence entre RIP classique et RIP natif (nRIP) ?
→ Le RIP natif est effectué sans crosslink, ce qui prévient les artéfacts de crosslink mais peut entraîner des artéfacts de réassociation.
55
Vrai ou Faux : Le RIP génère généralement peu de faux positifs.
→ Faux, il génère beaucoup de faux positifs.
56
Qu’est-ce que la méthode CLIP ?
→ Une immunoprécipitation basée sur un crosslink UV.
57
Quel est l’avantage principal du PAR-CLIP par rapport au CLIP classique ?
→ La formation du crosslink est plus efficace, ce qui permet une meilleure identification du site de liaison et réduit les faux positifs.
58
Sur quoi repose l’essai de marquage par proximité ?
→ Sur la proximité d'une protéine avec ses interacteurs.
58
Pourquoi combine-t-on RIP et CLIP avec des méthodes de séquençage à haut débit ?
→ Pour analyser à grande échelle les ARN associés aux protéines (RIP-Seq, HITS-CLIP, CLIP-Seq).
59
Avec quoi la protéine d’intérêt est-elle fusionnée dans l’essai de marquage par proximité ?
→ Avec une enzyme (soit une péroxidase, soit une biotine ligase).
60
Quelle enzyme est utilisée pour catalyser l’ajout de biotine dans le système basé sur une biotine ligase ?
→ La biotine ligase (ex : BioID, TurboID) active directement la biotine et la transfère aux protéines proches en présence d'ATP.
61
Que permet l’utilisation d'une péroxidase dans un essai de marquage par proximité ?
→ De marquer rapidement les protéines adjacentes via des radicaux biotinylés générés.
62
Que fait-on des protéines marquées après l’essai de marquage par proximité ?
→ Elles sont enrichies, digérées et analysées par spectrométrie de masse (MS).
63
Pourquoi utilise-t-on une "référence spatiale" dans un essai de marquage par proximité ?
→ Pour disposer d’un contrôle négatif afin d’éliminer les marquages non spécifiques dus à la localisation cellulaire.
64
Qu’est-ce qu’une "référence spatiale" dans ce contexte ?
→ Une enzyme de marquage (péroxidase ou biotine ligase) est exprimée seule, sans protéine cible fusionnée.
65
Pourquoi la comparaison avec la référence spatiale est-elle importante lors de l'analyse ?
→ Pour distinguer les protéines réellement en interaction des protéines simplement proches dans l’espace.
66
Quelle est la fonction de la streptavidine dans l’enrichissement des protéines marquées ?
→ Elle permet de capturer les protéines biotinylées grâce à sa forte affinité pour la biotine.
67
De quel type de structure est la streptavidine ?
→ La streptavidine est une protéine tétramérique.
68
Comment utilise-t-on la streptavidine pour purifier les protéines biotinylées ?
→ On utilise un support solide (comme des billes) conjugué à la streptavidine pour enrichir les protéines biotinylées.
69
Vrai ou Faux : L’enrichissement par streptavidine permet de purifier spécifiquement toutes les protéines présentes dans l’échantillon.
→ Faux. Il permet uniquement de purifier les protéines qui sont conjuguées à la biotine.
70
Quels sont les avantages de l’essai de marquage par proximité ? (2)
→ Il permet de déterminer les protéines proches de la protéine d’intérêt avant la lyse (ce qui évite les artéfacts)
→ D’estimer indirectement la localisation cellulaire de la protéine.
71
Quels sont les inconvénients de l’essai de marquage par proximité ? (3)
→ Il ne détecte que la proximité sans prouver une véritable interaction,
→ Il peut générer des faux positifs et négatifs en raison de la fusion entre la ligase et la protéine d’intérêt,
→ Il nécessite l’expression exogène d’une protéine de fusion, ce qui peut perturber la localisation cellulaire et modifier le métabolisme naturel.
72
Dans le système double hybride, combien de protéines hybrides construit-on ?
→ Deux protéines hybrides.
73
Que fusionne-t-on avec la protéine cible (appât) dans le double hybride ?
→ Le domaine de liaison à l’ADN (DBD) d’un activateur transcriptionnel.
74
Que fusionne-t-on avec la protéine partenaire (proie) dans le double hybride ?
→ Le domaine activateur (AD) d’un activateur transcriptionnel.
75
Quel est l’objectif de fusionner différentes protéines ou fragments à l’activateur (AD) ?
→ Identifier un domaine qui lie la protéine cible (c'est-à-dire trouver le partenaire d’interaction).
76
Où sont exprimés les gènes recombinants dans la méthode du double hybride ?
→ Chez la levure.
77
Dans le système du double hybride, que signifie la croissance d'une colonie de levure sur un milieu sélectif ?
→ Elle indique l'activation de la transcription du gène rapporteur due à une interaction entre la protéine appât et la protéine proie.
78
Quels sont les avantages de la méthode du double hybride ? (4)
→ Les interactions détectées sont en général directes,
→ Pas d’hypothèse nécessaire (on peut tester des banques d’ADNc),
→ Possibilité de tester la réciprocité en échangeant l’appât et la proie,
→ Méthode adaptée au criblage à haut débit.
79
Quels sont les inconvénients de la méthode du double hybride ? (3)
→ Beaucoup de faux positifs à cause de la surexpression des protéines de fusion dans un système artificiel (noyau de levure),
→ Le taux de faux positifs est élevé car les protéines peuvent ne pas être exprimées normalement,
→ On ne peut pas conclure à une absence d’interaction en cas de résultat négatif (risque de faux négatifs).
80
Dans la méthode de complémentation de fragments protéiques (PCA), que se passe-t-il lorsque deux fragments protéiques se rapprochent ?
→ Les deux fragments se réassocient pour reformer une protéine fonctionnelle.
81
Quel est le rôle de la dihydrofolate réductase (DHFR) dans la cellule ?
→ Elle catalyse la conversion de l’acide dihydrofolique (DHF) en acide tétrahydrofolique (THF), nécessaire au métabolisme des acides aminés et des nucléotides.
82
Quel inhibiteur est utilisé pour bloquer la DHFR endogène dans la méthode PCA basée sur la DHFR ?
→ Le méthotrexate.
83
Pourquoi utilise-t-on le méthotrexate dans la méthode PCA basée sur la DHFR ?
→ Le méthotrexate inhibe l’enzyme endogène, empêchant ainsi la croissance cellulaire si la complémentation de fragments ne se produit pas.
84
Que se passe-t-il s’il n’y a pas d’interaction entre les protéines A et B dans la méthode PCA ?
→ Pas de reconstitution de la DHFR fonctionnelle et donc pas de croissance en présence de méthotrexate.
85
Que se passe-t-il s’il y a interaction entre les protéines A et B dans la méthode PCA ?
→ Les fragments de la DHFR se recombinent, l’enzyme devient fonctionnelle et la cellule peut croître en présence de méthotrexate.
86
Quel est le rôle des contrôles positifs dans l'expérience de criblage PCA ?
→ Vérifier que le système expérimental fonctionne correctement en détectant des interactions connues.
87
Quel est le rôle des contrôles négatifs dans l'expérience de criblage PCA ?
→ Vérifier l'absence de croissance en l'absence d'interaction pour évaluer le bruit de fond du système.
88
Quels sont les avantages de la méthode PCA ? (4)
→ Permet l’étude d’interactions in vivo dans des compartiments cellulaires normaux avec un contrôle d’expression normal,
→ Méthode très sensible (détection dès 25 molécules par cellule),
→ Adaptée à plusieurs types cellulaires (levure, cellules de mammifères),
→ Diverses applications : criblage, identification de cibles thérapeutiques, visualisation de complexes protéiques.
89
Quels sont les inconvénients de la méthode PCA ?
→ Tendance à l’auto-assemblage des fragments protéiques,
→ La création de protéines de fusion peut masquer un site de liaison (créant des faux négatifs) ou créer un nouveau site artificiel (provoquant des faux positifs).
90
Qu'est-ce que l'interactome ?
→ Ensemble des interactions moléculaires dans une cellule.
91
Quel est l'intérêt de construire des cartes d'interactions protéine-protéine ?
→ Permet de regrouper les protéines en fonction de leurs interactions et de comprendre leur fonction biologique.
92
Vrai ou Faux : Les réseaux d'interactions peuvent aider à prédire la fonction d'une protéine inconnue.
→ Vrai.
93
Dans quelles conditions la vérification d’une interaction directe se fait-elle ?
→ Avec des macromolécules purifiées in vitro.
94
Que vérifie-t-on lors de la quantification d’une interaction in vitro ?
→ L'affinité et la spécificité de l'interaction.
95
Nomme trois méthodes utilisées pour quantifier les interactions in vitro.
→ Résonance plasmonique de surface
→ Calorimétrie à titrage isotherme
→ Retard sur gel
96
Quelle équation donne l’énergie libre de liaison ΔG ?
→ ΔG=RTlnKD
97
Quelle est l’autre forme équivalente pour exprimer ΔG ?
→ ΔG= ΔH - TΔS
98
Que mesure l’affinité entre deux molécules ?
→ L’affinité mesure la force de l’interaction non-covalente.
99
Comment est définie une grande affinité en termes de
𝐾𝐴 et 𝐾𝐷 ?
→ Plus l’affinité est grande, plus 𝐾𝐴 est élevé et plus 𝐾𝐷 est faible.
100
Que mesure la spécificité d’une molécule ?
→ La spécificité mesure la capacité d’une molécule de lier un ligand par rapport à d’autres.
101
Comment étudie-t-on généralement la spécificité ?
→ Par l’étude de la liaison de différents ligands pour comprendre les déterminants de la liaison.
102
Vrai ou Faux : Une haute affinité implique nécessairement une haute spécificité.
→ Faux : Haute affinité ≠ Haute spécificité.
103
Donne un exemple de protéine ayant une haute affinité mais une faible spécificité.
→ Une protéine chaperon (très forte affinité mais peu spécifique).
104
Qu’est-ce que la SPR ?
→ La SPR est une méthode biophysique qui permet de détecter en temps réel des interactions sur une molécule attachée à une surface (biocapteur).
105
La SPR permet-elle d’étudier des interactions en solution libre ?
→ Non, la SPR détecte uniquement des interactions sur une molécule immobilisée à une surface.
106
Que permet de mesurer la SPR en temps réel ?
→ La SPR permet de mesurer l’interaction entre un ligand immobilisé et un analyte en solution.
107
Avec quel type de préparation moléculaire peut-on utiliser la SPR ?
→ La SPR est utilisée seulement avec des protéines purifiées.
108
Qu’est-ce que permet de visualiser la SPR ?
→ La SPR permet de visualiser en temps réel les interactions entre biomolécules non marquées dans un flux continu de tampon.
109
Sur quoi est fixé le ligand dans une expérience SPR ?
→ Le ligand est retenu de manière spécifique sur une interface appelée biocapteur (sensor chip).
110
Quel est le rôle de l’analyte dans la SPR ?
→ L’analyte est dilué dans un tampon et circule à flux constant à la surface du biocapteur pour interagir avec le ligand immobilisé.
111
Comment la SPR détecte-t-elle l’association ou dissociation d’un complexe ?
→ La SPR détecte l’association ou la dissociation par modification de l’indice de réfraction, ce qui décale l'angle de résonance de la lumière réfléchie.
112
Que permet de suivre l’enregistrement de la variation de l’angle de résonance en SPR ?
→ Il permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur.
113
En quelles unités est exprimé le signal de résonance en SPR ?
→ Le signal est exprimé en unités de résonance (RU).
114
Qu’est-ce qu’un sensorgramme en SPR ?
→ Un sensorgramme est l’enregistrement du signal de résonance au cours du temps, indiquant l’association, la dissociation et la régénération.
115
Quels sont les avantages de la SPR (résonance plasmonique de surface) ? (6)
→ Étude des interactions en temps réel,
→ Applicable à un grand nombre de molécules (protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, particules virales, etc.),
→ Étude d’interactions complexes impliquant plus de deux partenaires,
→ Analyse rapide de plusieurs analytes,
→ Données cinétiques (kass et kdiss) et thermodynamiques (KD),
→ N’utilise pas de marqueurs fluorescents ou radioactifs.
116
Quels sont les inconvénients de la SPR ? (3)
→ L’immobilisation de la molécule sur la surface peut
interférer avec son activité,
→ L’immobilisation peut être non homogène,
→ La méthode ne permet pas d’évaluer l’homogénéité de l’échantillon.
117
Quelle est la fonction de la calorimétrie à titrage isotherme ?
→ C’est une méthode biophysique qui permet de mesurer la chaleur générée ou absorbée lors d’une interaction moléculaire en solution.
118
Quelle est la procédure générale d’une expérience de calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ?
→ On titre une solution de ligand dans une solution du partenaire de liaison dans la cellule expérimentale par plusieurs injections à intervalles réguliers.
119
Que mesure la calorimétrie à titrage isotherme lors d’une interaction moléculaire ?
→ La chaleur produite ou absorbée par la réaction de liaison.
120
Quelle différence est compensée dans une expérience de calorimétrie à titrage isotherme ?
→ La différence de chaleur (ΔT₁) entre la cellule expérimentale et la cellule de référence est mesurée et compensée.
121
Que constitue la puissance (μcal/sec) requise pour maintenir ΔT₁ constant à chaque injection ?
→ Elle constitue les données brutes de l'expérience.
122
Que permet de mesurer l'intégrale de la puissance en calorimétrie à titrage isotherme ?
→ Elle permet de mesurer la chaleur résultante (kcal/mol) du processus étudié.
123
Quels sont les avantages de la calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ? (4)
→ Détermine tous les paramètres de liaison (ΔH, KD, ΔG, ΔS, n) à partir d’une seule expérience,
→ Mesure directement des KD entre 10⁻² et 10⁻⁹ M, et indirectement par compétition jusqu’à 10⁻¹² M,
→ M éthode directe en solution,
→ Pas besoin de marquage ni d’immobilisation.
124
Quels sont les inconvénients de la calorimétrie à titrage isotherme ? (3)
→ Les paramètres thermodynamiques ne peuvent pas être mesurés si ΔH est faible ou nul,
→ Peut nécessiter beaucoup de matériel selon le KD,
→ Elle ne permet pas d’évaluer l’homogénéité de l’échantillon.
125
Quelle est la méthode standard pour étudier les interactions ARN/protéines et ADN/protéines ?
→ L'électrophorèse sur gel natif.
126
Que permet de déterminer la méthode de retard sur gel ?
→ Elle permet de déterminer si une protéine interagit directement avec une séquence donnée d’acide nucléique.
127
Que permet également d'établir la méthode de super-retard dans certains cas ?
→ Elle permet d'établir si plus d’une protéine interagit avec l’acide nucléique.
128
Quels sont les avantages du retard sur gel d’électrophorèse ? (5)
→ La méthode est facile à réaliser, nécessite peu de matériel et est peu coûteuse,
→ Elle mesure directement les KD (de 10⁻⁶ à 10⁻¹⁰ M),
→ Révèle plusieurs complexes et permet d’évaluer la stœchiométrie,
→ Utile pour définir un site de liaison sur l’acide nucléique et comparer différentes protéines mutantes,
→ Permet de vérifier l’homogénéité conformationnelle des macromolécules.
129
Quels sont les inconvénients du retard sur gel d’électrophorèse ? (4)
→ Ce n’est pas vraiment une méthode à l’équilibre,
→ L’ARN doit être marqué pour faciliter l’analyse,
→ Les complexes instables sont difficiles à détecter,
→ Elle est difficile à réaliser avec de petits peptides.
