Cours 3 Flashcards
Mesurer l’abondance des ARNm comment?
ARNm est instable on peut rien faire avec ca donc
transcriptase inverse (on va rendre ARNm poly adénylé en ADNc grace a une amorce polyT ou amorce aléatoires si l’ARNm n’a pas de queue poly A )
plusieurs méthodes possibles:
- PCR quantitative
SyBR green: détection de la formation D’adn double brin grace au SYBR green un agent intercalant fluorescent lorsque intercallé
PCR en temps réel: fluorescence mesurée à chaque cycle de PCR, un produit fluorescent apparait apres moins de cycles si le produit est abondant dans la phase exponentielle
- Analyse à haut débit du transcriptome par ARN-seq
- purifier ARN d’intéret
2.reverse transcriptase - séquencage a haut débit des ADNc et alignement des séquences au génome
4.mesure du nombre de fois qu’un ADNc associé à un gène donné est séquencé pour quantifier son expression
% des ARN qui sont des ARNm vs ARN ribosomaux dans la cellule
1-5% sont des ARNm
80% sont des ARN r
on retrouve l’uracil à la place de quel nucléo dans l’ARN
à la place du T (thymine) (truc=tu)
ARN est double ou simple brin
généralement simple brin mais des regions complementaires peuvent s’apparier formant des structures 3D complexes (cela change leur fonction)
ARN pol synthetise ..’ vers …’ à partir du brin… qui est …‘-…’
quel brin est pareil au brin d’ARNm
5’ vers 3’
matrice
3’ vers 5’
brin codant
identique ou différent:
les différents types cellulaires expriment habituellement des gènes
le génome des cellules est …
————————————-
Transcription continuelle de tous les gènes dans la cellule ?
quels stimulis peuvent activer la transcription de certains genes
10% différents-spécifiques et 90% identiques (ex:genes housekeeping)
identique (à quelques exceptions pres)
non, perte d’energie, on exprime seulement les genes qui code pour les prot necessaire de cette cellule
hormones, stress, dommages, etc…
à quoi servent les genes housekeeping
Fonctions de base de la cellule (croissance, cycle cellulaire, métabolisme)
Certains arnm sont abondants, chaque séquence presente en …. copies par cellules
represente en general moins de … sequences differentes
Certains arnm sont peu abondant, chaque séquence presente en …. copies par cellules
represente en general environ … sequences differentes
1000-10 000
100
moins de 10
10 000
Avantage et desavantage PCR en temps réel
a: facon peu couteuse de mesurer l’expression d’ARN spécifique
d: seulement quelques ARn peuvent etre mesurés à la fois (low throughput)
quelle est la methode pour mesurer l’abondance de l’ARN est la plus utilisé en ce moment
ARN seq
explique l’étape d’initiation de la transcription
Polymérase à ARN et protéines accessoires lient l’ADN. LADN est ouvert pour exposer le brin à transcrire et l’ARN polymérase commence à synthétiser l’ARN
vrai ou faux
LARN pol II peut lier l’ADN seule
FAUX
les régions UTR de l’ARNm ont quelle fonctions
régulent l’ARNm
leur séquence ou la structure quils forment peut influencer la stabilité. traduction, localisation
se fait souvent en liant des protéines
ou commence et se termine la transcription de l’ARNm ?
les ARNm contiennent donc beaucoup de séquences… en plus des introns.
Les UTR font partie des introns ou des exons ?
peut débuter plusieurs kb avant le codon de départ (ATG) et se terminer plusieurs kb après le codon stop
non codante
exons (ils ne sont pas enlevés lors de l’épissage)
l’initiation de la transcription dépend de la liaison de l’ARN pol à …
cette région contient… (2)
quels sont les éléments régulateurs de la transcription qui ne font pas partie de cette région
la région du promoteur
éléments de base et séquences régulatrices
les enhancers et les insulateurs qui sont à distance du promoteur
explique ce qu’est le complexe de pré-initiation (PIC)
l’aRN pol 2 et facteurs de transcription de base se lient aux éléments de base du promoteur pour former le complexe de pré-initiation
Nomme les éléments de base d’un promoteur eucaryote et ou on les retrouves
les promoteurs eucaryotes contiennent diverses combinaisons de ces éléments (pas necessairement tous la )
TSS (transcription start site) : site +1 ou la pol commence à synthétiser ARNm
Boite TATA: +30, seulement presente dans 10-25% des promoteurs parceque souvent seulement dans les gènes régulés (expression dans types cellulaires précis induit par stimuli)
Site BRE: avec boite TATA (amont ou aval)
Inr: englobe le site d’intiation de la transcription, peut fonctionner avec ou sans boite tata
DPE: entre +28 et +32, peut fonctionner avec ou sans boite tata
MTE: peut fonctionner avec ou sans boite tata
combien et quels facteurs de transcription de base se lient à des elements de base du promoteur pour former l’appareil de transcription de base?
la plupart de ces facteurs sont constitués de …
quel est le premier facteur a se lier à divers éléments de base du promoteur et quel est son rôle
6 facteurs : TFIIA, B, D, E, F, H
plusieurs sous-unités (>20 prot au total dans le complex)
TFIID : facilite l’association des autres facteurs de transcription de base, ce qui constitue le complexe de pré-initiation (PIC)
quelle partie de l’ARN pol II est une région essentielle pour la transcription chez les mammifères et pourquoi
la queue Cterminale de la sous unité RPB1 de l’ARN pol II
elle est hypophosphorylée dans le complexe d’initiation et hyperphosphorylé lors de l’élongation
les deux modes d’initiation de la transcription
mode focalisé: transcription débute à un ou peu de sites rapprochés les uns des autres. Souvent promoteurs avec boite TATA: génes dont l’expression est régulée et le niveau de transcription doit etre fort.
Mode dispersé: plusieurs sites faibles d’initiation de la transctiption dans une région 50-100 bp en amont de la séquence codante. Souvent promoteurs sans boite TATA: niveau de transcription plus faible mais constant. Peut inclure des génes housekeeping (plusieurs transcription en mm temps)
EXPLIQUE COMMENT LES DIFFÉRENTS TYPES DE SÉQUENCES RÉGULATRICES PERMETTENT DE RÉGULER L’EXPRESSION D’UN GÈNE
séquences régulatrices lient des protéines qui favorisent (activateurs) ou empêchent (répresseurs) la liaison des facteurs de transcription (TFII…) de base aux éléments de base du promoteurs pour la formation du PIC.
DANS PROMOTEUR:
1)séquences proximales lient des régulateurs protéiques DISTINCTS des facteurs de transcription de base à environ 100 bp en amont du TSS
2)séquences de type silencers lient des represseurs transcriptionnels= inhibent la formation du PIC
HORS DU PROMOTEUR
Enhancers: région régulatrice DISTALE pouvant agir a distance et favoriser ou inhiber l’expression. Situé en amont ou en aval du promoteur
qu’est ce qu’un response element ***
éléments controlant la réponse transcriptionnelle à un signal-stimulus spécifique
Il s’agit d’une séquence dans ou autour des gènes exprimés en réponse à l’activité d’un facteur de transcription particulier
différencie les recepteurs nucléaire de classe 1 et de classe 2 et leurs actions au niveau de la transcription
les deux permettent de moduler la transcription en réponse a un signal spécifique
Classe 1: en absence de ligand, le recepteur est séquestré au cytoplasme
liaison du ligand cause translocation du recepteur au noyau ou il active la transcription
Classe 2: recepteur est constitutivement nucléaire et lie un co-represseur (inhibe la transcription)
la liaison du ligand cause dissociation du co-represseur et liaison d’un co-activateur, ce qui active la transcription
quelle technique permet de quantifier la liaison d’une protéine d’intérêt à une séquence d’ADN
CHIP (chromatin immuno purification)
1)anticorps contre la prot d’intérêt envoyé avec ADN collé à la prot
2)purification des fragments d’ADN associés au facteur d’intérêt
3)analyse de l’ADN par qPCR ou séquencage haut débit
q PCR: permet une analyse ciblée de quelques sites d’intérêt (+ ou- de liaison a ce site)
Chip seq: permet de voir TOUT les sites liés par la protéine d’intérêt à l’échelle du génome
qu’est ce qu’un enhancer et un isolateur
enhancer: région d’adn (50/1500 pb) liée par facteurs de transcription pour influencer initiation et formation du PIC
peuvent etre jusqu’à 1Mb d’un gène (loin)
peuvent etre en amont, a l’interieur ou en aval du gène qu’ils régulent ou dans un intron dun gène quil régule ou d’un autre gène voisin par exemple
isolateurs: région d’ADN qui bloquent l’action non désirée d’un enhancer sur un promoteur
à quoi sert le complexe mediateur
truc : mediateur =milieu
liaison 1:agit comme un pont entre les facteurs liés aux séquences régulatrices et machinerie de transcription de base. (différentes de ses s-u vont lier diff protéines)
liaison 2: il se lie au domaine carboxy terminal de l’ARN pol2 non phosphorylé (au promoteur) et facilite la formation du complexe de préinitiation (PIC)
Lors de l’élongation, la queue CTD devient phosphorylé ce qui abolit la liaison avec le mediateur
comment on peut qualifier les facteurs liés aux séquences régulatrices d’activateur ou de represseur
les activateurs lient le mediateur le mettant dans une conformation qui favorise la formation du PIC
les represseurs lient le mediateur le mettant dans une conformation inhibant l’interaction entre l’ARN pol II et le promoetuer donc bloque la formation du PÏC
comment les enhancers peuvent agir à distance
le facteur de transcription se liant à l’enhancer peut aussi lier le complexe mediateur qui peut lier l’ARN polII pour favoriser la formation du PIC. Cela cré des booucles de chromatine.
comment restreindre l’effet d’un enhancer a une certaine région?
fomration de boucles par l’interaction entre sequences isolatrices permet de restreindre l’activité d’un enhancer a un domaine particulier a l’int de la boucle en question (si l’enhancer est dans la boucle mais pas le gène, il ne peut pas l’atteindre)
deux conditions pour qu ‘une protéine puisse agit comme activateur d’un gène (facteur de transcription)
- capable de se fixer à l’ADN ou d’interagir avec une protéine qui lie l’ADN (dans ce cas on appelle les prot co-activateur/co-represseur)
- capable d’interagir directement avec le PIC, mediateur ou d’autres facteurs de transcription afin de moduler la transcription
les facteurs de transcription ont donc un domaine de fixation a l’ADN et un domaine d’activation
les domaines suivant sont des domaines ….
riche en acides aminés acides (chargés négativement)
riche en glutamine
riche en proline
riche en isoleucine
9aaTAD
qui est ce qui interagit avec ces domaines
si on découvre ce genre de domaine dans une protéines non-caractérisée, qu’est ce que ca pourrait signifier?
d’activation
les TAFs (TBP-associated factors) ou le complexe mediateur interagissent physiquement avec les domaines d’activation de la transcription
peut suggérer un rôle de cette protéines dans la régulation de la transcription
quels sont les domaines/motifs protéiques de liaison à l’ADN
doigt de zinc
hélice tour hélice
Zipper de leucine
Hélice boucle hélice
doigt de zinc
1. structure secondaire
2. le contact se fait par l’intermédiaire de..
3. interagit avec quoi
4. que contient le motif
- en forme de doigt
- hélice alpha
- n’interagissent pas tous avec l’ADN, certain avec ARN, prot, lipide ou petites molécules
- souvent 2 cystéines, 2 histidines (CYs2/His2) ou 4 cystéines (CYS2/CYS2) qui coordonnent l’atome de Zinc
Motif hélice tout hélice
1. trimère ou dimère
2. combien d’hélice alpha et qu’elles lient l’ADN
3. sillon majeur ou mineur
4. exemple de facteur de transcription avec motif HTH
- dimère typiquement
- 3, l’hélice 2 et 3 lient l’ADN
- majeur (la dimérisation fait que les protéines lient les deux sillons majeurs adjacents)
- facteur de transcription HOX
Zipper de leucine
1. structure
2. dimère ou monomère
3. sillon majeur ou mineur
4. exemple ou on en retrouve
- séquence d’acide aminé ayant une leucine à tous les 7 résidus et formant une hélice alpha
- résidus de leucine interagissent avec les residus de leucine d’une autre prot pour former dimère (homo ou hétéro)
- la region adjacente aux leucines est basique et interagit avec le sillon majeur de l’ADN
- protooncogène (C-jun et C-fos)
hélice boucle hélice
1. structure
2. dimère ou monomère
3. sillon majeur ou mineur
4. exemple ou on en retrouve
- deux segments helicaux séparés par une boucle non structurée
- les helices permettent la dimerisation des facteurs la contenant
- une des helice est suivie d,une region basique qui lie l’ADN souvent au sillon majeur
- protooncogène Myc
Explique comment un petit repertoire de facteurs de transcription permet de réguler un grand nombre de gènes
les facteurs de transcription se fixent souvent à l’aDN sous forme de dimères /multimères
chaque monomère reconnait un demi-site du complexe. ainsi diverses combinaisons reconnaissent des elements distincts
on appelle ca la regulation combinatoire (ex: l’expression pourrait seulement se produire dans la cellule si les deux regulateurs transcriptionnels sont exprimés simultanément)
Explique la regulation negative par le motif helice boucle helice
les deux memebres du dimère de prot hélice boucle hélice doivent avoir le domaine basique pour se fixer à l’ADN. Par contre certains HBH n’ont pas ce domaine. Ainsi, un HBH n’ayant pas le domaine basique va empêcher la fixation du dimère.
la protéines libre sans domaine basique va donc agir comme un dominant négatif en inhibant l’activation des gènes sous controle de ce facteur
donne les exemples de facon de reguler les facteurs de transcription (général)
- phosphorylation / déphosphorylation du régulateur transcriptionnel (FT)
- liaison de ligand pour translocation au noyau (ex: classe 1 des recepteurs nucléaires)
- liaison par un inhibiteur protéique (ex: classe deux des recepteurs nucléaires)
- formation de dimère actif/inactif (ex: helice boucle helice)
initiation de l’élongation
liaison des facteurs de transcription de base (PIC) on débute la polymérisation de l’aDN
TFIIH a une activité hélicase qui ouvre les brins d’ADN à partir de -10 et ouvre environ 25 pb
l’arn pol peut générer ses premiers fragments
étapes de l’élongation
- plusieurs cycles d’élongation avortés (relachement d’arn tronqué de courte taille)
- promoter clearance: éloignement de l’ARn pol du promoteur et des facteurs de transcription de base (environ 10 bases d’ARN synthétisées)
- pause aux position +20 à +50 (autre opportunité de régulation)
- phospho de la CTD régule les pauses /promoter clearance
Terminaison de la transcription chez les eucaryotes
1) complexe enzymatique lie le CTD de l’ARN pol II et clive l’ARN dans le signal de polyadénylation (queue 3’ possède 80-250 A)
2) l’ARN relaché des alors polyadénylé par un complex enzymatique
