Cours 2

Question 1

Quelles sont les deux phases du principe de chromatographie? Décrit-les.

Answer 1

La phase mobile contient le mélange de substances à fractionner.
La phase stationnaire est celle au travers de laquelle les substances sont séparées.

Question 2

Quel est le principe de chromatographie?

Answer 2

Ce sont des substances qui intéragissent avec la phase stationnaire et leur migration est plus ou moins ralentie selon les propriétés de chaque substance.

Question 3

Quels sont les types de chromatographies et dans quelles circonstances les utilise-t-on?

Answer 3

1. La chromatographie par échange d’ions (interactions ioniques)
2. La chromatographie par gel filtration (taille)
3. La chromatographie d’affinité (spécificité)

Question 4

Un échangeur d’anions porte des groupes de quelle charge?

Answer 4

De chage positive

Question 5

Un échangeur de cations porte des groupes de quelle charge?

Answer 5

De charge négative

Question 6

Dans la chromatographie par échange d’ions, est-ce que la liaison est réversible ou irréversible?

Answer 6

Réversible

Question 7

Quels sont les 2 éléments qui dictent l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions? Pourquoi?

Answer 7

1. Le pH de la solution parce que la charge nette des protéines varie selon le pH
2. La nature et les concentrations des autres ions en solution qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions.

Question 8

Qu’est-ce qu’une matrice dans la chromatographie?

Answer 8

Ce sont des polymères insolubles préparés sous forme de billes qu’on appelle aussi résines.

Question 9

Quel est le polymère le plus utilisé pour composer les matrices des chromatographie par échange d’ions?

Answer 9

Les polysaccharides comme le cellulose ou ses dérivés, de l’agarose ou d’autres polymères.

Question 10

Quelle caractéristique important possède les polymères composant la matrice dans la chromatographie par échange d’ions?

Answer 10

Ils sont poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine.

Question 11

Les échangeurs utilisés en chromatiographie par échange d’ions dépendent de deux caractéristiques importantes. Lesquelles?

Answer 11

1. La nature de leur matrice
2. Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine.

Question 12

Chaque classe d’échangeurs (anioniques ou cationiques) se divise en deux groupes. Lesquel?

Answer 12

-Les échangeurs forts: restent pleinement chargés entre un pH de 3 et 10
-Les échangeurs faibles: chargés dans une gamme de pH plus restreint

Question 13

Comment se lient les protéines sur les échangeurs d’ions?

Answer 13

Par forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupement chargés sur l’échangeur

Question 14

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (métalliques, sel, tampon). Que doit faire la protéine dans ce cas?

Answer 14

Elle doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer.

Question 15

Lors de la chromatographie par échange d’ions, après la liaison à la colonne, quelle est la deuxième étape?

Answer 15

Le lavage de la colonne à l’aide d’une solution tampon

Question 16

Vrai ou faux.
Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée.

Answer 16

Vrai

Question 17

Lors de la chromatographie par échange d’ions, après le lavage de la colonne, quelle est la troisième étape? Explique.

Answer 17

L’élution consiste à éluder les protéines liées à l’échangeur d’ions par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage.

Question 18

Quels sont les deux sels utilisés principalement pour l’élution d’une protéine?

Answer 18

Le Nacl et le KCl

Question 19

Que fait le sel lors du processus d’élution?

Answer 19

Il déplace la protéine en occupant les sites chargés de sorte que la protéine ne peut plus se rattacher et tombe.

Question 20

Décrit la concentration saline utilisée pour le procédé d’élution fractionnée.

Answer 20

La concentration saline augmente à chaque élution.

Question 21

À quoi sert la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire?

Answer 21

Pour séparer les molécules selon leur taille et forme.

Question 22

Quels sont les trois grands principes de la méthode de chromatographie par gel-filtration?

Answer 22

1. La phase stationnaire est composée de résine sous forme de billes
2. Les pores de billes du gel sont assez grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais pas les plus grosses
3. Les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores (grosses) traversent la colonne plus rapidement que celles qui sont retenues.

Question 23

Quelle est l’unité de mesure de la masse des protéines?

Answer 23

En Daltons (Da) ou en kilodaltons (kDa)

Question 24

Dans la chromatographie par gel-filtration, quels sont les polymères les plus communément utilisés pour façonner les matrices?

Answer 24

Les polysaccharides comme le dextrine, l’agarose ou le polyacrylamide

Question 25

Quels sont les deux éléments qui font varier la porosité des gels lors de la chromatographie par gel-filtration?

Answer 25

-La masse moléculaire du polymère -Le nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontage)

Question 26

Vrai ou faux. Plus la colonne de filtration est petite, plus la séparation est meilleure.

Answer 26

Faux. Plus la colonne est grande, plus la séparation est meilleure.

Question 27

Vrai ou faux. Les protéines de grandes tailles sont exclues de la plupart des pores et se déplacent avec la solution tampon ajouter.

Answer 27

Vrai

Question 28

Vrai ou faux. Les plus petites billes seront éluées en premier lors de la chromatographie par gel-filtration.

Answer 28

Faux. Les plus grosses billes seront éluées en premier.

Question 29

À quoi correspond le volume d'élution d'une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve)?

Answer 29

C'est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne.

Question 30

Que permet d'estimer le volume d'élution relatif (Ve/Vo) d'une protéine?

Answer 30

La masse moléculaire d'une protéine

Question 31

La dialyse permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à quels type de membrances?

Answer 31

Semi-perméables (ont des pores de taille inférieur aux protéines)

Question 32

Les membranes semi-perméables de la dialyse sont fait de quelle base?

Answer 32

Cellophane (cellulose)

Question 33

Pourquoi voudrions-nous utiliser la technique de la dialyse?

Answer 33

Pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après l'élution avec un tampon riche en sels d'une colonne de chromatographie par échange d'ions

Question 34

Est-ce que la centrifugation sur colonne-filtre est une forme de dialyse?

Answer 34

Oui.

Question 35

Dans la chromatographie d'affinité, comment se nomme la molécule qui se lie spécifiquement à la protéine d'intérêt et comment le fait-elle?

Answer 35

Un ligand se lie de manière covalence à une matrice poreuse et inerte.

Question 36

Comment peut-on récupérer la protéine désirée sous forme très pure en la détachant de son ligand?

Answer 36

1. Ajouter un excès de ligand libre dans la colonne (celui-ci entre en compétiton pour la liaison de la protéine) 2. Changer le ph 3. Changer la force ionique 4. Changer la température

Question 37

Quel est l'avantage de la chromatographie d'affinité?

Answer 37

-On utilise les propriétés biochimiques plutôt que physico-chimiques de la protéine. -Permet un haut degré de pureté en une seule étape -rapide, efficace, fiable

Question 38

Comment se nomme la mesure d'affinité entre la protéine et son ligand?

Answer 38

La constante de dissociation

Question 39

Quelles sont les conditions à respecter pour la matrice utilisée lors de la chromatographie d'affinité?

Answer 39

1. Chimique inerte 2. Avoir une grande porosité 3. Présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands

Question 40

Quel est le polymère le plus utilisé pour la matrice d'une chromatographie d'affinité?

Answer 40

L'agarose

Question 41

Quels sont les deux étapes de liaison entre la matrice d'agarose et le ligand?

Answer 41

1. Rx de l'agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire activée et stable 2. le ligand réagit avec l'agarose activé pour donner un produit lié par covalence

Question 42

Vrai ou faux. Plusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène à cause d'interférence stérique avec la matrice d'agarose.

Answer 42

Vrai. (On ajoute un bras espaceur souple entre la matrice et le ligand)