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TP biochimie > Cours 2 > Flashcards

Cours 2 Flashcards

1
Q

Quelles sont les deux phases du principe de chromatographie? Décrit-les.

A

La phase mobile contient le mélange de substances à fractionner.
La phase stationnaire est celle au travers de laquelle les substances sont séparées.

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2
Q

Quel est le principe de chromatographie?

A

Ce sont des substances qui intéragissent avec la phase stationnaire et leur migration est plus ou moins ralentie selon les propriétés de chaque substance.

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3
Q

Quels sont les types de chromatographies et dans quelles circonstances les utilise-t-on?

A
  1. La chromatographie par échange d’ions (interactions ioniques)
  2. La chromatographie par gel filtration (taille)
  3. La chromatographie d’affinité (spécificité)
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4
Q

Un échangeur d’anions porte des groupes de quelle charge?

A

De chage positive

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5
Q

Un échangeur de cations porte des groupes de quelle charge?

A

De charge négative

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6
Q

Dans la chromatographie par échange d’ions, est-ce que la liaison est réversible ou irréversible?

A

Réversible

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7
Q

Quels sont les 2 éléments qui dictent l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions? Pourquoi?

A
  1. Le pH de la solution parce que la charge nette des protéines varie selon le pH
  2. La nature et les concentrations des autres ions en solution qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions.
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8
Q

Qu’est-ce qu’une matrice dans la chromatographie?

A

Ce sont des polymères insolubles préparés sous forme de billes qu’on appelle aussi résines.

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9
Q

Quel est le polymère le plus utilisé pour composer les matrices des chromatographie par échange d’ions?

A

Les polysaccharides comme le cellulose ou ses dérivés, de l’agarose ou d’autres polymères.

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10
Q

Quelle caractéristique important possède les polymères composant la matrice dans la chromatographie par échange d’ions?

A

Ils sont poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine.

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11
Q

Les échangeurs utilisés en chromatiographie par échange d’ions dépendent de deux caractéristiques importantes. Lesquelles?

A
  1. La nature de leur matrice
  2. Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine.
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12
Q

Chaque classe d’échangeurs (anioniques ou cationiques) se divise en deux groupes. Lesquel?

A

-Les échangeurs forts: restent pleinement chargés entre un pH de 3 et 10
-Les échangeurs faibles: chargés dans une gamme de pH plus restreint

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13
Q

Comment se lient les protéines sur les échangeurs d’ions?

A

Par forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupement chargés sur l’échangeur

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14
Q

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (métalliques, sel, tampon). Que doit faire la protéine dans ce cas?

A

Elle doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer.

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15
Q

Lors de la chromatographie par échange d’ions, après la liaison à la colonne, quelle est la deuxième étape?

A

Le lavage de la colonne à l’aide d’une solution tampon

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16
Q

Vrai ou faux.
Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée.

A

Vrai

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17
Q

Lors de la chromatographie par échange d’ions, après le lavage de la colonne, quelle est la troisième étape? Explique.

A

L’élution consiste à éluder les protéines liées à l’échangeur d’ions par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage.

18
Q

Quels sont les deux sels utilisés principalement pour l’élution d’une protéine?

A

Le Nacl et le KCl

19
Q

Que fait le sel lors du processus d’élution?

A

Il déplace la protéine en occupant les sites chargés de sorte que la protéine ne peut plus se rattacher et tombe.

20
Q

Décrit la concentration saline utilisée pour le procédé d’élution fractionnée.

A

La concentration saline augmente à chaque élution.

21
Q

À quoi sert la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire?

A

Pour séparer les molécules selon leur taille et forme.

22
Q

Quels sont les trois grands principes de la méthode de chromatographie par gel-filtration?

A
  1. La phase stationnaire est composée de résine sous forme de billes
  2. Les pores de billes du gel sont assez grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais pas les plus grosses
  3. Les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores (grosses) traversent la colonne plus rapidement que celles qui sont retenues.
23
Q

Quelle est l’unité de mesure de la masse des protéines?

A

En Daltons (Da) ou en kilodaltons (kDa)

24
Q

Dans la chromatographie par gel-filtration, quels sont les polymères les plus communément utilisés pour façonner les matrices?

A

Les polysaccharides comme le dextrine, l’agarose ou le polyacrylamide

25
Q

Quels sont les deux éléments qui font varier la porosité des gels lors de la chromatographie par gel-filtration?

A

-La masse moléculaire du polymère
-Le nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontage)

26
Q

Vrai ou faux.
Plus la colonne de filtration est petite, plus la séparation est meilleure.

A

Faux. Plus la colonne est grande, plus la séparation est meilleure.

27
Q

Vrai ou faux.
Les protéines de grandes tailles sont exclues de la plupart des pores et se déplacent avec la solution tampon ajouter.

A

Vrai

28
Q

Vrai ou faux.
Les plus petites billes seront éluées en premier lors de la chromatographie par gel-filtration.

A

Faux. Les plus grosses billes seront éluées en premier.

29
Q

À quoi correspond le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve)?

A

C’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne.

30
Q

Que permet d’estimer le volume d’élution relatif (Ve/Vo) d’une protéine?

A

La masse moléculaire d’une protéine

31
Q

La dialyse permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à quels type de membrances?

A

Semi-perméables (ont des pores de taille inférieur aux protéines)

32
Q

Les membranes semi-perméables de la dialyse sont fait de quelle base?

A

Cellophane (cellulose)

33
Q

Pourquoi voudrions-nous utiliser la technique de la dialyse?

A

Pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après l’élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions

34
Q

Est-ce que la centrifugation sur colonne-filtre est une forme de dialyse?

A

Oui.

35
Q

Dans la chromatographie d’affinité, comment se nomme la molécule qui se lie spécifiquement à la protéine d’intérêt et comment le fait-elle?

A

Un ligand se lie de manière covalence à une matrice poreuse et inerte.

36
Q

Comment peut-on récupérer la protéine désirée sous forme très pure en la détachant de son ligand?

A
  1. Ajouter un excès de ligand libre dans la colonne (celui-ci entre en compétiton pour la liaison de la protéine)
  2. Changer le ph
  3. Changer la force ionique
  4. Changer la température
37
Q

Quel est l’avantage de la chromatographie d’affinité?

A

-On utilise les propriétés biochimiques plutôt que physico-chimiques de la protéine.
-Permet un haut degré de pureté en une seule étape
-rapide, efficace, fiable

38
Q

Comment se nomme la mesure d’affinité entre la protéine et son ligand?

A

La constante de dissociation

39
Q

Quelles sont les conditions à respecter pour la matrice utilisée lors de la chromatographie d’affinité?

A
  1. Chimique inerte
  2. Avoir une grande porosité
  3. Présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands
40
Q

Quel est le polymère le plus utilisé pour la matrice d’une chromatographie d’affinité?

A

L’agarose

41
Q

Quels sont les deux étapes de liaison entre la matrice d’agarose et le ligand?

A
  1. Rx de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire activée et stable
  2. le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
42
Q

Vrai ou faux.
Plusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène à cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose.

A

Vrai. (On ajoute un bras espaceur souple entre la matrice et le ligand)

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