Cours 1 Flashcards
Quelle est la première étape d’une purification des protéines?
Les dissoudre dans une phase liquide
Quelle méthode pouvons-nous utiliser pour libérérer les protéines des cellules où elles se trouvent? (explique la méthode aussi)
La lyse osmotique: Les cellules sont suspendues dans une solution hypotonique (solution dont la concentration molaire en soluté est inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule)
Qu’arrive-t-il lorsqu’il y a une différence de concentration suite à la lyse osmotique?
Une pression osmotique se créer, ce qui provoque le gonflement et éventuellement, l’éclatement de la cellule
La lyse cellulaire est utilisée pour quelle type de cellules et pourquoi?
Cellules animales puisqu’elles n’ont pas de paroi cellulaire
Quelle est l’étape de plus pour les cellules bactériennes, de levures ou végétales afin de libérer les protéines?
L’utilisation de lysozyme est une enzyme qui permet de dégrader les parois cellulaires
Quelles sont les techniques employées afin de désintégrer mécaniquement un tissus pour briser les cellules?
- broyage (avec du sable, de l’alumine, ou des petites billes de verre)
- déchiquetage mécanique
- homogénéisateur
- rupture à haute pression (french press)
- sonification par vibration ultrasonique
Comment se nomme le produit de la lyse cellulaire?
Le lysat
Que peut-on faire avec le lysat afin d’enlever les particules ou débris cellulaires qui ne correspondent pas à la protéine d’intérêt?
Le lysat peut être filtré ou centrifugé
L’intégrité structurale des protéines et leur stabilité dépendent de 3 facteurs. Lesquels?
pH, température et protéase
Pour éviter d’endommager les protéines, quelle solution et son pH devons-nous utiliser et pourquoi?
Nous devons utiliser des solutions tampons qui maintiennent le pH dans une zone “physiologique” (6,5-7,5-8).
Qu’arrive-t-il aux protéines à de hautes températures?
Elles sont dénaturées.
À quelle température se fait normalement la purification des protéines?
0-5°C
Lorsque purifiée, les protéines se conservent à quelle température?
-20 à -80 °C
Que sont les protéases?
Ce sont des enzymes qui hydrolysent les liens peptidiques
Comment pouvons-nous empêcher la dégradation des protéines par les protéases?
En utilisant des inhibiteurs de protéases
Qu’est-ce que la purification par méthode de fractionnement?
Utiliser les différentes propriétés physico-chimiques des protéines pour l’isoler progressivement
Quelles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les techniques de séparation?
- solubilité
- charge ionique
- taille moléculaire
- propriétés d’absorption/de liaison à d’autres molécules biologiques (spécificité)
Quelle(s) technique(s) de séparation pouvons-nous utiliser pour la solubilité?
La précipitation
Quelle(s) technique(s) de séparation pouvons-nous utiliser pour la charge ionique?
La chromatographie par échange d’ions
Électrophorèse
Focalisation isoélectrique
Quelle(s) technique(s) de séparation pouvons-nous utiliser pour la taille moléculaire?
Ultracentrifugation
Chromatographie par gel-filtration
Électrophorèse
Quelle(s) technique(s) de séparation pouvons-nous utiliser pour la spécifité?
Chromatographie d’affinité
Qu’est-ce que la méthode de précipitation?
Diminuer sélectivement la solubilité des protéines dans l’eau.
Que représente la structure primaire des protéines?
La séquence en acides aminés de la chaîne polypeptidique
Que représente la structure secondaire des protéines?
Motifs de repliement
Que représente la structure tertiaire des protéines?
Le repliement de la séquence polypeptidique
Que représente la structure quaternaire des protéines?
L’assemblage des polypeptides de structures tertiaires ensemble
La solubilité d’une protéine dépend de quoi (3)?
- Les interactions polaires avec le solvant aqueux (pont H avec l’eau)
- Les interactions ioniques avec les sels en solution
- Des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire
Qu’est-ce que les facteurs de solubilité permettent?
Augementent les interactions avec la solution et diminuent les interactions prot-prot, empêchant l’agrégation des protéine
Afin que la précipitaiton des protéines surviennent, que doit-il arriver?
Elles doivent s’agréger ensemble = interactions prot-prot
Quelles variations peut-on apporter pour diminuer la solubilité d’une protéine?
- la force ionique (concentration saline)
- le pH
- Ajout de solvants inorganiques (ex: éthanol)
- Ajout de polymères inertes
Choisir l’énoncé vrai.
a. La solubilité d’une protéine varie selon la nature des ions en solution et augmente avec la concentration de sels en solution.
b. La solubilité d’une protéine varie selon la nature des ions en solution et diminue avec la concentration de sels en solution.
a.
Vrai ou faux.
La solubilité d’une protéine diminue après l’atteinte d’une certaine valeur (plateau)
vrai
L’augmentation en solubilité avec une concentration en sels est connue sous quel nom?
Salting in
Qu’arrive-t-il lors du phénomène de salting in?
Les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité parce que:
-les sels augmentent les interactions avec l’eau
-les sels augmentent la répulsion entre protéines (diminution d’agrégation)
Vrai ou faux.
La dialyse contre un tampon de faible force ionique peut provoquer la précipitation des protéines
Vrai
Vrai ou faux.
Le dessalage ou “salting out” est l’une des techniques les moins utilisées en purification des protéines.
Faux, c’est l’une des plus utilisées.
Le phénomène du salting out est dû à quoi?
La compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la solvatation (donc l’accès aux molécules d’eau)
Vrai ou faux.
Lors du phénomène de salting out, l’hydratation des ions de sels a une forte tendance à séquestrer les molécules d’eau.
Vrai
Qu’est-ce que la séquestration de l’eau lors du salting out implique?
Une diminution de la solvatation (hydratation) des protéines
Vrai ou faux.
Plus les protéines sont hydratées/solvatée, plus elles ont tendance à s’agréger.
Faux, lorsque les protéines sont mois hydratées/solvatées, cela favorise leur agrégation
Quelles régions des protéines seront les premières à être moins bien solvatées lors du salting out?
Les régions hydrophobes
Vrai ou faux.
Les protéines hydrophiles nécessitent moins de sels pour précipiter
Faux, elles nécessitent plus de sels
Pour la précipitation des protéines, quel est le nom des sels qui se lient et intéragissent directement avec la protéine?
Chaotropiques (favorisent dénaturation des prots en affectant leurs structures)
Pour la précipitaiton des protéines, quel est le nom des sels qui encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec celle-ci?
Les sels optimaux (conservent la structure 3D des prots)
Vrai ou faux.
Le sel le plus utilisé pour la précipitation des protéines est le citrate.
Faux, c’est le sulfate d’ammonium
Qu’est-ce que la précipitation différentielle?
En fonction de la charge ionique de la solution, les protéines précipitent à différents moments à cause de leur séquence et de leur hydrophobicité.
Que représente le pH isoélectrique?
pH où une protéine a autant de charges positives que négatives (charge nette de 0)
Au point isoélectrique, une protéine a tendance a devenir plus ou moins soluble?
Moins, puisqu’elle minimise la répulsion électrique et permet aux forces électrostatiques locales de prédominer menant ainsi à une attirance entre les molécules (agrégation-précipitation)
Quel nom donne-t-on au phénomène qui permet de purifier une protéine sélectivement en amenant le pH à son point isoélectrique?
La précipitaiton isoélectrique
L’addition d’un solvant miscible avec l’eau (éthanol, acétone) à un mélange contenant des protéines diminue ou augmente leur solubilité?
Diminue
Qu’est-ce que réflète la constante diélectrique?
La polarité d’un solvant
Vrai ou faux.
Les solvants organique diminuent l’hydratation de surface et augmentent la surface hydrophobe.
Vrai et favorise l’agrégation des protéines, comme le dessalage
Est-ce plus une protéine est grande, la concentration en solvant organique nécessaire afin de la faire précipiter est plus basse?
Oui, puiqu’elle possède une surface plus grande, donc une meilleure chance d’avoir une région à la surface chargée qui est complémentaire avec une autre protéine.
