Clonaggio Flashcards
Caratteristiche plasmidi
DNA extra- cromosomi Ale, circolare, doppio filamento, superavvolto
Per clonaggio si usano 2000-5000bp
Elementi in Cis, ORF, sito di restrizione, marcatore di selezione
Creazione DNA ricombinante
Enzimi di restrizione (endonucleasi e metiltransferasi) classi 3. Isoschizomeri e isocaudameri
Sequenza di riconoscimento (palindrome a simmetria invertita)
DNA ligasi con ATP
Modicare estremità sporgentj
Filling ends (frammento di klenow con DNA pol1) e trimming end (nucleasi S1)
Modificare estremità dna
Linker (oligonucleotidi complementari) da una parte estremità piatte dall’ altro no
Adattatori (oligonucleotidi parzialmente complementari) estremità sporgentj entrambe
Evitare ricircolarizzazione plasmide
Fosfatasi alcalina
Enzimi di restrizione diversi
Come trasformare DNA ricombinante in Cell ospite e strategie
Trascrizione chimica ed elettroporazione. Inserire nel secondo gene marcatore
Selezione dei trasformati
Alfa complementazione
Analisi in elettroforesi dopo enzimi restrizione
Applicazioni del clonaggio
Espressione genica, regolazione espressione, mutagenesi, fare sonde singolo filamento
Caratteristiche plasmidi gene eterologo in Cell procariotiche
ORF
Siti di restrizione unici
Marcatore per selezione
Elementi per inizio e terminazione trascrizione (promotore Operoni) e traduzione (Seq Shine delgarno)
Poi: Seq operatore, gene che codifica per repressore
Caratteristiche gene eterologo in cellule di mammiferi
ORF
Sito multiplo di clonaggio
Marcatore di selezione per E.coli e per Cell euc
Elementi per inizio terminazione trascrizione (promotore RNA Pol 2)
poi: regione enhancer, origine replicazione virale
Tipi di trasfezione
Stabile o transiente
Tag della proteina e perche
In c e n terminale
> Stabilità, solubilità, livelli di espressione
Identificare prodotto di espressione
Purificare più facilmente
Analisi elementi regolatori dell’ espressione genica
Vettori reporter
Analisi elementi regolatori stabilità mRna o efficienza traduzione
5’ e 3’ UTR
primo a monte della regione che codifica per gene reporter, poi a valle
Analisi funzione dei geni. Come è fatto plasmide
SìRNA che porta ad inattivazione genica per degradazione mRNA o blocco traduzione
Ori
Sito multiplo clonaggio
Marcatore selezione
Promotore eu
Sito poliadenilazione delimita sito multiplo di clonaggio
Shrna,
Mutagenesi sito specifica a cassetta per rimpiazzi amento
Cloni DNA esogeno con PCR. Rimuovo la porzione da mutare con enzimi restrizione, inserisco mutazioni
Rimpiazzi con mutazione, inserisco nel vettore e valuto vettore di espressione (modifica regione che codifica per proteina ottengo proteina mutata) e promotori (modifica promotore vedo se mutazione influenza o no trascrizione del gene reporter)
Mutagenesi per inserimento di selezione successive
Trovo residui fondamentali del promotore
DNA nel vettore viene linearizzato, poi digerito da enzimi restrizione (uno estremità 5’ e uno 3’ sporgente)
La porzione rimossa trattata con esonucleasi 3 che rimuove nucleotidi in 5’. Poi rimossa estremità 3’ con nucleasi S1 che crea estremità piatte per inserire in plasmide
