Clonaggio

Question 1

Caratteristiche plasmidi

Answer 1

DNA extra- cromosomi Ale, circolare, doppio filamento, superavvolto
Per clonaggio si usano 2000-5000bp
Elementi in Cis, ORF, sito di restrizione, marcatore di selezione

Question 2

Creazione DNA ricombinante

Answer 2

Enzimi di restrizione (endonucleasi e metiltransferasi) classi 3. Isoschizomeri e isocaudameri
Sequenza di riconoscimento (palindrome a simmetria invertita)
DNA ligasi con ATP

Question 3

Modicare estremità sporgentj

Answer 3

Filling ends (frammento di klenow con DNA pol1) e trimming end (nucleasi S1)

Question 4

Modificare estremità dna

Answer 4

Linker (oligonucleotidi complementari) da una parte estremità piatte dall’ altro no
Adattatori (oligonucleotidi parzialmente complementari) estremità sporgentj entrambe

Question 5

Evitare ricircolarizzazione plasmide

Answer 5

Fosfatasi alcalina
Enzimi di restrizione diversi

Question 6

Come trasformare DNA ricombinante in Cell ospite e strategie

Answer 6

Trascrizione chimica ed elettroporazione. Inserire nel secondo gene marcatore

Question 7

Selezione dei trasformati

Answer 7

Alfa complementazione
Analisi in elettroforesi dopo enzimi restrizione

Question 8

Applicazioni del clonaggio

Answer 8

Espressione genica, regolazione espressione, mutagenesi, fare sonde singolo filamento

Question 9

Caratteristiche plasmidi gene eterologo in Cell procariotiche

Answer 9

ORF
Siti di restrizione unici
Marcatore per selezione
Elementi per inizio e terminazione trascrizione (promotore Operoni) e traduzione (Seq Shine delgarno)

Poi: Seq operatore, gene che codifica per repressore

Question 10

Caratteristiche gene eterologo in cellule di mammiferi

Answer 10

ORF
Sito multiplo di clonaggio
Marcatore di selezione per E.coli e per Cell euc
Elementi per inizio terminazione trascrizione (promotore RNA Pol 2)

poi: regione enhancer, origine replicazione virale

Question 11

Tipi di trasfezione

Answer 11

Stabile o transiente

Question 12

Tag della proteina e perche

Answer 12

In c e n terminale
> Stabilità, solubilità, livelli di espressione
Identificare prodotto di espressione
Purificare più facilmente

Question 13

Analisi elementi regolatori dell’ espressione genica

Answer 13

Vettori reporter

Question 14

Analisi elementi regolatori stabilità mRna o efficienza traduzione

Answer 14

5’ e 3’ UTR
primo a monte della regione che codifica per gene reporter, poi a valle

Question 15

Analisi funzione dei geni. Come è fatto plasmide

Answer 15

SìRNA che porta ad inattivazione genica per degradazione mRNA o blocco traduzione
Ori
Sito multiplo clonaggio
Marcatore selezione
Promotore eu
Sito poliadenilazione delimita sito multiplo di clonaggio
Shrna,

Question 16

Mutagenesi sito specifica a cassetta per rimpiazzi amento

Answer 16

Cloni DNA esogeno con PCR. Rimuovo la porzione da mutare con enzimi restrizione, inserisco mutazioni
Rimpiazzi con mutazione, inserisco nel vettore e valuto vettore di espressione (modifica regione che codifica per proteina ottengo proteina mutata) e promotori (modifica promotore vedo se mutazione influenza o no trascrizione del gene reporter)

Question 17

Mutagenesi per inserimento di selezione successive

Answer 17

Trovo residui fondamentali del promotore
DNA nel vettore viene linearizzato, poi digerito da enzimi restrizione (uno estremità 5’ e uno 3’ sporgente)
La porzione rimossa trattata con esonucleasi 3 che rimuove nucleotidi in 5’. Poi rimossa estremità 3’ con nucleasi S1 che crea estremità piatte per inserire in plasmide