Biotech : ADN recombinant P1 Flashcards
1
Q
Définition de l’ADN recombinant ?
A
Induction de sécrétion d’un produit à partir d’un système génétiquement modifié par expression d’un gène étrangé
2
Q
Quelles sont les principales étapes de mise en place d’un ADN recombinant ?
A
- Insertion gène d’intérêt dans un plasmide ou bactériophage)
- Introduction dans le génome de bactérie
- Clonage → multiplication des bactéries
- Culture des bactéries
- Lyse des cellules
- Extraction, purification de la protéine
3
Q
Quel est l’objectif d’un ADN recombinant ?
A
- Isoler des fragment d’ADN de génome complexe
- Recombiner dans des génomes + petit et + faciles à manipuler/analyser
4
Q
Que sont les produit que l’on obtient par ADN recombinant ?
A
Protéines ++
5
Q
Intérêt de la méthode de l’ADN recombinant ?
A
- Source non limité
- pure
- Production de protéines modifiées + facilement
6
Q
Quelles sont les 2 étapes de production de protéines recombinantes ?
A
1) Extraction du gène d’intérêt à partir de l’organisme donneur
2) Transfert du gène d’intérêt dans l’organisme receveur
7
Q
Quel sont les éléments nécessaire à la production de protéines recombinantes ?
A
- Système d’introduction
- Système d’amplification
- Vecteur d’expression
- Marqueur de sélection
*Stratégie d’extraction et de purification adaptée - Origine de réplication
8
Q
A quoi servent les marqueur de sélection ?
A
S’assurer que l’ADN recombinant est bien intégré dans le génome de la bactérie
9
Q
Quel est le rôle des vecteur de l’ADN recombinant ?
A
Permettre l’amplification de l’ADN fragment
10
Q
Quels sont les vecteur d’ADN utilisé ?
A
- Plasmide +++
- Bactériophage
11
Q
Caractéristiques des plasmides ?
A
- Petit ADN circulaire → bactéries
- pUC18 = le + connu
- Insertion possible de fragment de 1 à 5 kbases
11
Q
Composition des plasmides ?
A
- Séquence promoteur
- Origine de réplication
- Marqueur de sélection
- Site pour les enzymes de restrictions
11
Q
A quoi sert la séquence promoteur ?
A
A être reconnue par l’ ARN polymérase
12
Q
Quel est le rôle des enzyme de restriction ?
A
Reconnaitre des séquence bien particulière et les couper
13
Q
A quoi sert le site pour les enzymes restrictives ?
A
Endroit d’insertion du morceau d’ADN
14
Q
Quel taille le fragment d’ADN recombiner peut faire pour être intégré dans les bactériophage ?
A
10 à 20 kbases
15
Q
Quelles enzymes sont utilisé pour insérer le fragment d’ADN d’intérêt ?
A
Endonucléases → enzyme de restriction
16
Q
Caractéristiques des enzymes de restriction ?
A
- 1ers instrument pour manipuler le patrimoine génétique
- Moyen de défense bactérien pour lutter contre virus
- Spécifique de séquence palindromique
17
Q
Fonctionnement des enzymes de restriction ?
A
Reconnaissance de la séquence → clivage → création d’extrémité cohésive → appareillement → reliage par ligase
18
Q
Comment est nommée (nomenclature) une enzyme restrictive ?
A
- 1ère lettre : Majuscule, genre du µorga dans lequel elle a été isolé
- 2 lettres suivante : nom de l’espèce
- Fin : Chiffre romain, nombre d’enzyle de restriction isolé de l’espèce
19
Q
Quelles sont les méthode possible pour réaliser une transduction ?
A
- Chimique : phosphate de calcium
- Electroporation
- Réactif à base de lipide
20
Q
En quoi consiste l’électroporation ?
A
Insertion de partie d’ADN en utilisant un voltage (kV) par pulse précise
21
Q
A quoi sert le criblage ?
A
Savoir quelle cell/bactérie à intégré l’ADN recombinant
22
Q
Quelles sont les méthodes de criblage ?
A
- Hybridation d’une sonde marquée
- Multiplication et induction
23
Comment fonction le criblage à partir de l'hybridation de la sonde ?
1) Réplicata des colonies avec papier buvard
2) lyses des bactéries sur le papier buvard avec bases alcaline
3) Hybridation avec une sonde d'ADN complémentaire marquée
4) Si il y a eu intégration colonie visible à l'autoradiographie
24
Principe du criblage par multiplication et induction ?
→ 2 criblage
1) Résistance au ATB
2) Perte de la fonction clivage des enzyme de restriction
25
Comment savoir si il y a perte de la fonction clivage des enzyme de restriction → intégration de l'ADN recombinant ?
Ex pUC18
β galactosidase clive X-gal → coloration bleu
Si il n'y a pas de changement de couleur : ADN intgré
26
Que signifie λ dans bactériophage λ ?
On a retiré sa pathogénécité
27
Comment les bactéries sont infectées par les bactériophage ?
* Accolement de la queue à la parois cellulaire
* Transfert d'ADN dans la bactérie
* Transcription des gènes du phage par ARN polymérase
* Traduction de l'ARNm correspondant
* Nouvelle réplication de l'ADN du phage → liaison spontanée des protéines "tête" et "queue"
* Lyse des bactéries hôtes pour obtenir la protéine d'intérêt après purification
28
Quels sont les systèmes d'expression de protéines existant ?
Expression :
* Bactérienne
* Par levure
* Par cellules d'insects/baculovirus
* De cellules mammifère
* De cellules végétales
29
Avantage de l'expression bactérienne ?
* Fermenta° + transforma° simple
* Rendement élevé
* Systèmes bien connus
* Protéines exprimées dans les corps d'inclusion
30
Inconvénients de l'expression bactérienne des protéines ?
* Protéines exprimées dans les corps d'inclusion
* Pas de modification post transcriptionnelles
* Repliement anormale de protéines liées par des pont dissulfures
31
Avantages de l'expression par levure des protéines ?
* Fermentation + transforma° simple
* Rendement élevé
* Systèmes d'expression bien étudiés
* Modification pot transcriptionnelle
32
Inconvénients de l'expression de protéines par levure ?
* Repliement anormal des protéines liées par des pont disulfures
* Hypoglycosilation
33
Avantage de l'expression des protéine par cellules d'insectes/baculovirus ?
* Rendement modéré
* Nombreuse modification post transcriptionnelle
* Repliement correct des protéines
34
Inconvénient de l'expression des protéines par cellules d'insectes / baculovirus ?
* Fermentation + complexe
* Besoin de produire et maintenir les baculovirus recombinant
* Glycosylations différentes
35
Avantages de l'expression des protéines par les cellules mammifère ?
* Toute modification post transcriptionnelle
* Repliement correct des protéines
* Correcte glycosylation
36
Inconvénient de l'expression des protéines par les cellules mammifère ?
* Fermentation + complexe
* Faible rendement
* Coût de production augmenté
37
En quoi consiste le scale-up ?
Petit schéma → vérifier dans le cours
38
En quoi consiste le downstream pocess ?
La lyse des organisme contenant les produit d'intérêt et leur purification
39
Quand est-ce que la lyse est nécessaire ?
Quand les produit sont intracellulaires
40
Comment peut être faite la lyse ?
De façon :
* Mécanique
* Chimique
* Enzymatique
41
Exemple de méthode de lyse mécanique ?
* Gel/dégel
* Homogénéisation
* Pression ou sonication
42
Exemple de technique de lyse chimique ?
* Bases
* Détergent
* Solvant organiques
43
Exemple de technique de lyse enzymatique ?
* Lysozyme (+EDTA)
* Combinaison d'enzymes particulières selon la composition de la parois que l'on veut détruire
44
Quelle sont les différentes méthodes de purifications ?
* Clarification
* Précipitation
* Concentration
* Séparation chromatographique
45
Comment se classent les produits biologiques ?
* Produit issus de l'ADN recombinant
* Produit non issus de l'ADN recombinant
46
Quels sont les produits biologique issus de l'ADN recombinant ?
* Dérivé d'acide nucléiques
* Protéines recombinantes
- Protéines thérapeutiques
47
Quand à été découverte l'insuline et par qui ?
1920 → F. Banting et C. Best
48
Caractéristiques de l'insuline ?
* Hormone polypeptidique
* Produite par cell béta îlots de langerhans
49
Rôles de l'insuline ?
* Régulation des carbohydrates, protéine, AG
* Effet hypoglycémiant
50
Structure de l'insuline ?
* 2 chaines polypeptidiques
- Chaine A : 21 AA + pont disulfure
- Chaine B : 30 AA
* 2 ponts disulfures inter chaine
* Structure en dimère ou hexamère possible
51
Relation entre les insulines bovine, humaine et porcine ?
Analogie importante peu de différence
52
Quelles sont les différentes formes de l'insulines ?
Pré-pro-insuline → proinsuline → insuline mature
53
Comment obtient on la pro insuline ?
* Clivage et perte du séquence signal sur la pré-pro-insuline
* Formation des ponts disulfure (3)
54
Comment obtient on l'insuline mature ?
Perte du peptide C
55
Quelles sont les propriété physico-chimique de l'insuline ?
* Instabilité des pont disulfure
* Sensibilité à l'acidité et protéases
* Solubilité dans l'eau assez bonne
* pHi = 5,4
* Forme des complexe avec Zn ou protamine
56
Que permet la formation de complexe avec l'insuline ?
Stockage de l'hormone dans le verre pour une longue période d'action
57
Méthode de production de l'insuline à partir de pancréas bovin ou porcin ?
Voir schéma cours
58
Quelles sont les méthode de production de l'insuline humaine ?
Ingénierie génétique :
* Genentech
* Eli-Lilly et Novo-Nordisk
59
Quels sont les différents type d'insulines pouvant être produit ?
* Suspension d'insuline
* Analogue d'insuline rapide ou lente
60
Caractéristique de la suspension d'insuline ?
* A base de Zn, complexe de Zn et protamine
* Insuline isophane → durée d'action immédiate
61
Noms d'analogues d'insuline rapide ?
* Humalog → Insulin lispro
* Novarapid → Insulin aspart
* Apidra → Insulin glulisine
62
Modifications appliquées à l'insuline lispro ?
B28 → Lysine
B29 → Proline
63
Modifications apportées à l'insuline aspart ?
B28 → Aspartate
64
Modifications apportées à l'insuline glusiline ?
B29 → Glutamine
B3 → Lysine
65
Comment ralentir l'action de l'insuline ?
Augmenter sa lipophilie
66
Nom d'analogue d'insuline à action lente ?
* Lantus → Insulin Glargine
* Levemir → Insulin determir
67
Modifications apportées à l'insuline glargine ?
A21 → Glycine
+ B31 → Arginine
+ B32 → Arginine
68
Modifications apportées à l'insuline detemir ?
- B30 → Thréonine
+ Chaine d'acide gras
69
Quelles sont les grandes étape de la production industrielle d'insuline humaine ?
1) Recombinaison
2) Transformation
3) Fermentation
4) Extraction purification
5) Modifications
6) Purification chromatographique
70
Quelles sont les principales étapes de production d'un produit par l'ADN recombinant ?
1) Clonage de l'ADN
2) Fermentation
3) Extraction
4) Purification
5) Préparation pharmaceutique
71
Dans l'organisme Hu quels organes produisent l'hormone de croissance ?
* Glande pituitaire
* Hypophyse
72
Structure de l'hormone de croissance ?
191 AA
73
Structure du gène humain utilisé pour la recombinaison de l'ADN de l'hormone de croissance ?
* 2 seq non codantes
* 1 seq peptide signal
* 1 seq hormone de croissance SANS introns
74
Avantage de l'utilisation de la méthode "shock" pour libérer l'hormone ?
Le choc osmotique créer des pores dans la bactérie et un protéase coupe la méthionine avant que la protéine n'en sorte
→ Facilité de purification car pas de morceau de bactérie partout
