Biotech : ADN recombinant P1 Flashcards
Définition de l’ADN recombinant ?
Induction de sécrétion d’un produit à partir d’un système génétiquement modifié par expression d’un gène étrangé
Quelles sont les principales étapes de mise en place d’un ADN recombinant ?
- Insertion gène d’intérêt dans un plasmide ou bactériophage)
- Introduction dans le génome de bactérie
- Clonage → multiplication des bactéries
- Culture des bactéries
- Lyse des cellules
- Extraction, purification de la protéine
Quel est l’objectif d’un ADN recombinant ?
- Isoler des fragment d’ADN de génome complexe
- Recombiner dans des génomes + petit et + faciles à manipuler/analyser
Que sont les produit que l’on obtient par ADN recombinant ?
Protéines ++
Intérêt de la méthode de l’ADN recombinant ?
- Source non limité
- pure
- Production de protéines modifiées + facilement
Quelles sont les 2 étapes de production de protéines recombinantes ?
1) Extraction du gène d’intérêt à partir de l’organisme donneur
2) Transfert du gène d’intérêt dans l’organisme receveur
Quel sont les éléments nécessaire à la production de protéines recombinantes ?
- Système d’introduction
- Système d’amplification
- Vecteur d’expression
- Marqueur de sélection
*Stratégie d’extraction et de purification adaptée - Origine de réplication
A quoi servent les marqueur de sélection ?
S’assurer que l’ADN recombinant est bien intégré dans le génome de la bactérie
Quel est le rôle des vecteur de l’ADN recombinant ?
Permettre l’amplification de l’ADN fragment
Quels sont les vecteur d’ADN utilisé ?
- Plasmide +++
- Bactériophage
Caractéristiques des plasmides ?
- Petit ADN circulaire → bactéries
- pUC18 = le + connu
- Insertion possible de fragment de 1 à 5 kbases
Composition des plasmides ?
- Séquence promoteur
- Origine de réplication
- Marqueur de sélection
- Site pour les enzymes de restrictions
A quoi sert la séquence promoteur ?
A être reconnue par l’ ARN polymérase
Quel est le rôle des enzyme de restriction ?
Reconnaitre des séquence bien particulière et les couper
A quoi sert le site pour les enzymes restrictives ?
Endroit d’insertion du morceau d’ADN
Quel taille le fragment d’ADN recombiner peut faire pour être intégré dans les bactériophage ?
10 à 20 kbases
Quelles enzymes sont utilisé pour insérer le fragment d’ADN d’intérêt ?
Endonucléases → enzyme de restriction
Caractéristiques des enzymes de restriction ?
- 1ers instrument pour manipuler le patrimoine génétique
- Moyen de défense bactérien pour lutter contre virus
- Spécifique de séquence palindromique
Fonctionnement des enzymes de restriction ?
Reconnaissance de la séquence → clivage → création d’extrémité cohésive → appareillement → reliage par ligase
Comment est nommée (nomenclature) une enzyme restrictive ?
- 1ère lettre : Majuscule, genre du µorga dans lequel elle a été isolé
- 2 lettres suivante : nom de l’espèce
- Fin : Chiffre romain, nombre d’enzyle de restriction isolé de l’espèce
Quelles sont les méthode possible pour réaliser une transduction ?
- Chimique : phosphate de calcium
- Electroporation
- Réactif à base de lipide
En quoi consiste l’électroporation ?
Insertion de partie d’ADN en utilisant un voltage (kV) par pulse précise
A quoi sert le criblage ?
Savoir quelle cell/bactérie à intégré l’ADN recombinant
Quelles sont les méthodes de criblage ?
- Hybridation d’une sonde marquée
- Multiplication et induction
Comment fonction le criblage à partir de l’hybridation de la sonde ?
1) Réplicata des colonies avec papier buvard
2) lyses des bactéries sur le papier buvard avec bases alcaline
3) Hybridation avec une sonde d’ADN complémentaire marquée
4) Si il y a eu intégration colonie visible à l’autoradiographie
Principe du criblage par multiplication et induction ?
→ 2 criblage
1) Résistance au ATB
2) Perte de la fonction clivage des enzyme de restriction
Comment savoir si il y a perte de la fonction clivage des enzyme de restriction → intégration de l’ADN recombinant ?
Ex pUC18
β galactosidase clive X-gal → coloration bleu
Si il n’y a pas de changement de couleur : ADN intgré
Que signifie λ dans bactériophage λ ?
On a retiré sa pathogénécité
Comment les bactéries sont infectées par les bactériophage ?
- Accolement de la queue à la parois cellulaire
- Transfert d’ADN dans la bactérie
- Transcription des gènes du phage par ARN polymérase
- Traduction de l’ARNm correspondant
- Nouvelle réplication de l’ADN du phage → liaison spontanée des protéines “tête” et “queue”
- Lyse des bactéries hôtes pour obtenir la protéine d’intérêt après purification
Quels sont les systèmes d’expression de protéines existant ?
Expression :
* Bactérienne
* Par levure
* Par cellules d’insects/baculovirus
* De cellules mammifère
* De cellules végétales
Avantage de l’expression bactérienne ?
- Fermenta° + transforma° simple
- Rendement élevé
- Systèmes bien connus
- Protéines exprimées dans les corps d’inclusion
Inconvénients de l’expression bactérienne des protéines ?
- Protéines exprimées dans les corps d’inclusion
- Pas de modification post transcriptionnelles
- Repliement anormale de protéines liées par des pont dissulfures
Avantages de l’expression par levure des protéines ?
- Fermentation + transforma° simple
- Rendement élevé
- Systèmes d’expression bien étudiés
- Modification pot transcriptionnelle
Inconvénients de l’expression de protéines par levure ?
- Repliement anormal des protéines liées par des pont disulfures
- Hypoglycosilation
Avantage de l’expression des protéine par cellules d’insectes/baculovirus ?
- Rendement modéré
- Nombreuse modification post transcriptionnelle
- Repliement correct des protéines
Inconvénient de l’expression des protéines par cellules d’insectes / baculovirus ?
- Fermentation + complexe
- Besoin de produire et maintenir les baculovirus recombinant
- Glycosylations différentes
Avantages de l’expression des protéines par les cellules mammifère ?
- Toute modification post transcriptionnelle
- Repliement correct des protéines
- Correcte glycosylation
Inconvénient de l’expression des protéines par les cellules mammifère ?
- Fermentation + complexe
- Faible rendement
- Coût de production augmenté
En quoi consiste le scale-up ?
Petit schéma → vérifier dans le cours
En quoi consiste le downstream pocess ?
La lyse des organisme contenant les produit d’intérêt et leur purification
Quand est-ce que la lyse est nécessaire ?
Quand les produit sont intracellulaires
Comment peut être faite la lyse ?
De façon :
* Mécanique
* Chimique
* Enzymatique
Exemple de méthode de lyse mécanique ?
- Gel/dégel
- Homogénéisation
- Pression ou sonication
Exemple de technique de lyse chimique ?
- Bases
- Détergent
- Solvant organiques
Exemple de technique de lyse enzymatique ?
- Lysozyme (+EDTA)
- Combinaison d’enzymes particulières selon la composition de la parois que l’on veut détruire
Quelle sont les différentes méthodes de purifications ?
- Clarification
- Précipitation
- Concentration
- Séparation chromatographique
Comment se classent les produits biologiques ?
- Produit issus de l’ADN recombinant
- Produit non issus de l’ADN recombinant
Quels sont les produits biologique issus de l’ADN recombinant ?
- Dérivé d’acide nucléiques
- Protéines recombinantes
- Protéines thérapeutiques
Quand à été découverte l’insuline et par qui ?
1920 → F. Banting et C. Best
Caractéristiques de l’insuline ?
- Hormone polypeptidique
- Produite par cell béta îlots de langerhans
Rôles de l’insuline ?
- Régulation des carbohydrates, protéine, AG
- Effet hypoglycémiant
Structure de l’insuline ?
- 2 chaines polypeptidiques
- Chaine A : 21 AA + pont disulfure
- Chaine B : 30 AA
- 2 ponts disulfures inter chaine
- Structure en dimère ou hexamère possible
Relation entre les insulines bovine, humaine et porcine ?
Analogie importante peu de différence
Quelles sont les différentes formes de l’insulines ?
Pré-pro-insuline → proinsuline → insuline mature
Comment obtient on la pro insuline ?
- Clivage et perte du séquence signal sur la pré-pro-insuline
- Formation des ponts disulfure (3)
Comment obtient on l’insuline mature ?
Perte du peptide C
Quelles sont les propriété physico-chimique de l’insuline ?
- Instabilité des pont disulfure
- Sensibilité à l’acidité et protéases
- Solubilité dans l’eau assez bonne
- pHi = 5,4
- Forme des complexe avec Zn ou protamine
Que permet la formation de complexe avec l’insuline ?
Stockage de l’hormone dans le verre pour une longue période d’action
Méthode de production de l’insuline à partir de pancréas bovin ou porcin ?
Voir schéma cours
Quelles sont les méthode de production de l’insuline humaine ?
Ingénierie génétique :
* Genentech
* Eli-Lilly et Novo-Nordisk
Quels sont les différents type d’insulines pouvant être produit ?
- Suspension d’insuline
- Analogue d’insuline rapide ou lente
Caractéristique de la suspension d’insuline ?
- A base de Zn, complexe de Zn et protamine
- Insuline isophane → durée d’action immédiate
Noms d’analogues d’insuline rapide ?
- Humalog → Insulin lispro
- Novarapid → Insulin aspart
- Apidra → Insulin glulisine
Modifications appliquées à l’insuline lispro ?
B28 → Lysine
B29 → Proline
Modifications apportées à l’insuline aspart ?
B28 → Aspartate
Modifications apportées à l’insuline glusiline ?
B29 → Glutamine
B3 → Lysine
Comment ralentir l’action de l’insuline ?
Augmenter sa lipophilie
Nom d’analogue d’insuline à action lente ?
- Lantus → Insulin Glargine
- Levemir → Insulin determir
Modifications apportées à l’insuline glargine ?
A21 → Glycine
+ B31 → Arginine
+ B32 → Arginine
Modifications apportées à l’insuline detemir ?
- B30 → Thréonine
+ Chaine d’acide gras
Quelles sont les grandes étape de la production industrielle d’insuline humaine ?
1) Recombinaison
2) Transformation
3) Fermentation
4) Extraction purification
5) Modifications
6) Purification chromatographique
Quelles sont les principales étapes de production d’un produit par l’ADN recombinant ?
1) Clonage de l’ADN
2) Fermentation
3) Extraction
4) Purification
5) Préparation pharmaceutique
Dans l’organisme Hu quels organes produisent l’hormone de croissance ?
- Glande pituitaire
- Hypophyse
Structure de l’hormone de croissance ?
191 AA
Structure du gène humain utilisé pour la recombinaison de l’ADN de l’hormone de croissance ?
- 2 seq non codantes
- 1 seq peptide signal
- 1 seq hormone de croissance SANS introns
Avantage de l’utilisation de la méthode “shock” pour libérer l’hormone ?
Le choc osmotique créer des pores dans la bactérie et un protéase coupe la méthionine avant que la protéine n’en sorte
→ Facilité de purification car pas de morceau de bactérie partout
