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{P2} UE2.1 > Biotech : ADN recombinant P1 > Flashcards

Biotech : ADN recombinant P1 Flashcards

1
Q

Définition de l’ADN recombinant ?

A

Induction de sécrétion d’un produit à partir d’un système génétiquement modifié par expression d’un gène étrangé

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Q

Quelles sont les principales étapes de mise en place d’un ADN recombinant ?

A
  • Insertion gène d’intérêt dans un plasmide ou bactériophage)
  • Introduction dans le génome de bactérie
  • Clonage → multiplication des bactéries
  • Culture des bactéries
  • Lyse des cellules
  • Extraction, purification de la protéine
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Q

Quel est l’objectif d’un ADN recombinant ?

A
  • Isoler des fragment d’ADN de génome complexe
  • Recombiner dans des génomes + petit et + faciles à manipuler/analyser
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Q

Que sont les produit que l’on obtient par ADN recombinant ?

A

Protéines ++

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Q

Intérêt de la méthode de l’ADN recombinant ?

A
  • Source non limité
    • pure
  • Production de protéines modifiées + facilement
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6
Q

Quelles sont les 2 étapes de production de protéines recombinantes ?

A

1) Extraction du gène d’intérêt à partir de l’organisme donneur
2) Transfert du gène d’intérêt dans l’organisme receveur

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7
Q

Quel sont les éléments nécessaire à la production de protéines recombinantes ?

A
  • Système d’introduction
  • Système d’amplification
  • Vecteur d’expression
  • Marqueur de sélection
    *Stratégie d’extraction et de purification adaptée
  • Origine de réplication
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8
Q

A quoi servent les marqueur de sélection ?

A

S’assurer que l’ADN recombinant est bien intégré dans le génome de la bactérie

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9
Q

Quel est le rôle des vecteur de l’ADN recombinant ?

A

Permettre l’amplification de l’ADN fragment

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10
Q

Quels sont les vecteur d’ADN utilisé ?

A
  • Plasmide +++
  • Bactériophage
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11
Q

Caractéristiques des plasmides ?

A
  • Petit ADN circulaire → bactéries
  • pUC18 = le + connu
  • Insertion possible de fragment de 1 à 5 kbases
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11
Q

Composition des plasmides ?

A
  • Séquence promoteur
  • Origine de réplication
  • Marqueur de sélection
  • Site pour les enzymes de restrictions
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11
Q

A quoi sert la séquence promoteur ?

A

A être reconnue par l’ ARN polymérase

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12
Q

Quel est le rôle des enzyme de restriction ?

A

Reconnaitre des séquence bien particulière et les couper

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13
Q

A quoi sert le site pour les enzymes restrictives ?

A

Endroit d’insertion du morceau d’ADN

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14
Q

Quel taille le fragment d’ADN recombiner peut faire pour être intégré dans les bactériophage ?

A

10 à 20 kbases

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15
Q

Quelles enzymes sont utilisé pour insérer le fragment d’ADN d’intérêt ?

A

Endonucléases → enzyme de restriction

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16
Q

Caractéristiques des enzymes de restriction ?

A
  • 1ers instrument pour manipuler le patrimoine génétique
  • Moyen de défense bactérien pour lutter contre virus
  • Spécifique de séquence palindromique
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17
Q

Fonctionnement des enzymes de restriction ?

A

Reconnaissance de la séquence → clivage → création d’extrémité cohésive → appareillement → reliage par ligase

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18
Q

Comment est nommée (nomenclature) une enzyme restrictive ?

A
  • 1ère lettre : Majuscule, genre du µorga dans lequel elle a été isolé
  • 2 lettres suivante : nom de l’espèce
  • Fin : Chiffre romain, nombre d’enzyle de restriction isolé de l’espèce
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19
Q

Quelles sont les méthode possible pour réaliser une transduction ?

A
  • Chimique : phosphate de calcium
  • Electroporation
  • Réactif à base de lipide
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20
Q

En quoi consiste l’électroporation ?

A

Insertion de partie d’ADN en utilisant un voltage (kV) par pulse précise

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21
Q

A quoi sert le criblage ?

A

Savoir quelle cell/bactérie à intégré l’ADN recombinant

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22
Q

Quelles sont les méthodes de criblage ?

A
  • Hybridation d’une sonde marquée
  • Multiplication et induction
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23
Q

Comment fonction le criblage à partir de l’hybridation de la sonde ?

A

1) Réplicata des colonies avec papier buvard
2) lyses des bactéries sur le papier buvard avec bases alcaline
3) Hybridation avec une sonde d’ADN complémentaire marquée
4) Si il y a eu intégration colonie visible à l’autoradiographie

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24
Q

Principe du criblage par multiplication et induction ?

A

→ 2 criblage
1) Résistance au ATB
2) Perte de la fonction clivage des enzyme de restriction

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25
Q

Comment savoir si il y a perte de la fonction clivage des enzyme de restriction → intégration de l’ADN recombinant ?

A

Ex pUC18
β galactosidase clive X-gal → coloration bleu
Si il n’y a pas de changement de couleur : ADN intgré

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26
Q

Que signifie λ dans bactériophage λ ?

A

On a retiré sa pathogénécité

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27
Q

Comment les bactéries sont infectées par les bactériophage ?

A
  • Accolement de la queue à la parois cellulaire
  • Transfert d’ADN dans la bactérie
  • Transcription des gènes du phage par ARN polymérase
  • Traduction de l’ARNm correspondant
  • Nouvelle réplication de l’ADN du phage → liaison spontanée des protéines “tête” et “queue”
  • Lyse des bactéries hôtes pour obtenir la protéine d’intérêt après purification
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28
Q

Quels sont les systèmes d’expression de protéines existant ?

A

Expression :
* Bactérienne
* Par levure
* Par cellules d’insects/baculovirus
* De cellules mammifère
* De cellules végétales

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29
Q

Avantage de l’expression bactérienne ?

A
  • Fermenta° + transforma° simple
  • Rendement élevé
  • Systèmes bien connus
  • Protéines exprimées dans les corps d’inclusion
30
Q

Inconvénients de l’expression bactérienne des protéines ?

A
  • Protéines exprimées dans les corps d’inclusion
  • Pas de modification post transcriptionnelles
  • Repliement anormale de protéines liées par des pont dissulfures
31
Q

Avantages de l’expression par levure des protéines ?

A
  • Fermentation + transforma° simple
  • Rendement élevé
  • Systèmes d’expression bien étudiés
  • Modification pot transcriptionnelle
32
Q

Inconvénients de l’expression de protéines par levure ?

A
  • Repliement anormal des protéines liées par des pont disulfures
  • Hypoglycosilation
33
Q

Avantage de l’expression des protéine par cellules d’insectes/baculovirus ?

A
  • Rendement modéré
  • Nombreuse modification post transcriptionnelle
  • Repliement correct des protéines
34
Q

Inconvénient de l’expression des protéines par cellules d’insectes / baculovirus ?

A
  • Fermentation + complexe
  • Besoin de produire et maintenir les baculovirus recombinant
  • Glycosylations différentes
35
Q

Avantages de l’expression des protéines par les cellules mammifère ?

A
  • Toute modification post transcriptionnelle
  • Repliement correct des protéines
  • Correcte glycosylation
36
Q

Inconvénient de l’expression des protéines par les cellules mammifère ?

A
  • Fermentation + complexe
  • Faible rendement
  • Coût de production augmenté
37
Q

En quoi consiste le scale-up ?

A

Petit schéma → vérifier dans le cours

38
Q

En quoi consiste le downstream pocess ?

A

La lyse des organisme contenant les produit d’intérêt et leur purification

39
Q

Quand est-ce que la lyse est nécessaire ?

A

Quand les produit sont intracellulaires

40
Q

Comment peut être faite la lyse ?

A

De façon :
* Mécanique
* Chimique
* Enzymatique

41
Q

Exemple de méthode de lyse mécanique ?

A
  • Gel/dégel
  • Homogénéisation
  • Pression ou sonication
42
Q

Exemple de technique de lyse chimique ?

A
  • Bases
  • Détergent
  • Solvant organiques
43
Q

Exemple de technique de lyse enzymatique ?

A
  • Lysozyme (+EDTA)
  • Combinaison d’enzymes particulières selon la composition de la parois que l’on veut détruire
44
Q

Quelle sont les différentes méthodes de purifications ?

A
  • Clarification
  • Précipitation
  • Concentration
  • Séparation chromatographique
45
Q

Comment se classent les produits biologiques ?

A
  • Produit issus de l’ADN recombinant
  • Produit non issus de l’ADN recombinant
46
Q

Quels sont les produits biologique issus de l’ADN recombinant ?

A
  • Dérivé d’acide nucléiques
  • Protéines recombinantes
    • Protéines thérapeutiques
47
Q

Quand à été découverte l’insuline et par qui ?

A

1920 → F. Banting et C. Best

48
Q

Caractéristiques de l’insuline ?

A
  • Hormone polypeptidique
  • Produite par cell béta îlots de langerhans
49
Q

Rôles de l’insuline ?

A
  • Régulation des carbohydrates, protéine, AG
  • Effet hypoglycémiant
50
Q

Structure de l’insuline ?

A
  • 2 chaines polypeptidiques
  • Chaine A : 21 AA + pont disulfure
  • Chaine B : 30 AA
  • 2 ponts disulfures inter chaine
  • Structure en dimère ou hexamère possible
51
Q

Relation entre les insulines bovine, humaine et porcine ?

A

Analogie importante peu de différence

52
Q

Quelles sont les différentes formes de l’insulines ?

A

Pré-pro-insuline → proinsuline → insuline mature

53
Q

Comment obtient on la pro insuline ?

A
  • Clivage et perte du séquence signal sur la pré-pro-insuline
  • Formation des ponts disulfure (3)
54
Q

Comment obtient on l’insuline mature ?

A

Perte du peptide C

55
Q

Quelles sont les propriété physico-chimique de l’insuline ?

A
  • Instabilité des pont disulfure
  • Sensibilité à l’acidité et protéases
  • Solubilité dans l’eau assez bonne
  • pHi = 5,4
  • Forme des complexe avec Zn ou protamine
56
Q

Que permet la formation de complexe avec l’insuline ?

A

Stockage de l’hormone dans le verre pour une longue période d’action

57
Q

Méthode de production de l’insuline à partir de pancréas bovin ou porcin ?

A

Voir schéma cours

58
Q

Quelles sont les méthode de production de l’insuline humaine ?

A

Ingénierie génétique :
* Genentech
* Eli-Lilly et Novo-Nordisk

59
Q

Quels sont les différents type d’insulines pouvant être produit ?

A
  • Suspension d’insuline
  • Analogue d’insuline rapide ou lente
60
Q

Caractéristique de la suspension d’insuline ?

A
  • A base de Zn, complexe de Zn et protamine
  • Insuline isophane → durée d’action immédiate
61
Q

Noms d’analogues d’insuline rapide ?

A
  • Humalog → Insulin lispro
  • Novarapid → Insulin aspart
  • Apidra → Insulin glulisine
62
Q

Modifications appliquées à l’insuline lispro ?

A

B28 → Lysine
B29 → Proline

63
Q

Modifications apportées à l’insuline aspart ?

A

B28 → Aspartate

64
Q

Modifications apportées à l’insuline glusiline ?

A

B29 → Glutamine
B3 → Lysine

65
Q

Comment ralentir l’action de l’insuline ?

A

Augmenter sa lipophilie

66
Q

Nom d’analogue d’insuline à action lente ?

A
  • Lantus → Insulin Glargine
  • Levemir → Insulin determir
67
Q

Modifications apportées à l’insuline glargine ?

A

A21 → Glycine
+ B31 → Arginine
+ B32 → Arginine

68
Q

Modifications apportées à l’insuline detemir ?

A
  • B30 → Thréonine
    + Chaine d’acide gras
69
Q

Quelles sont les grandes étape de la production industrielle d’insuline humaine ?

A

1) Recombinaison
2) Transformation
3) Fermentation
4) Extraction purification
5) Modifications
6) Purification chromatographique

70
Q

Quelles sont les principales étapes de production d’un produit par l’ADN recombinant ?

A

1) Clonage de l’ADN
2) Fermentation
3) Extraction
4) Purification
5) Préparation pharmaceutique

71
Q

Dans l’organisme Hu quels organes produisent l’hormone de croissance ?

A
  • Glande pituitaire
  • Hypophyse
72
Q

Structure de l’hormone de croissance ?

A

191 AA

73
Q

Structure du gène humain utilisé pour la recombinaison de l’ADN de l’hormone de croissance ?

A
  • 2 seq non codantes
  • 1 seq peptide signal
  • 1 seq hormone de croissance SANS introns
74
Q

Avantage de l’utilisation de la méthode “shock” pour libérer l’hormone ?

A

Le choc osmotique créer des pores dans la bactérie et un protéase coupe la méthionine avant que la protéine n’en sorte
→ Facilité de purification car pas de morceau de bactérie partout

{P2} UE2.1 (8 decks)

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