Biochemie - 5. Genová terapie Flashcards
1
Q
Genová terapie - definice
A
= využití terapeutického dodávání NK do buněk pacienta jako léčiva k léčbě onemocnění
- koncepce od roku 1972 spolu s etikou - článek Gene therapy for human genetic diseases
2
Q
Genová terapie - historie
A
- pokus o modifikaci lidské DNA v 1980 - Martin Cline - NESCHVÁLENO
- úspěšný pokus přenosu jaderného genu u lidí, 1989 - SCHVÁLENO
- terapeutické použití přenosu genů + 1. přímé vložení lidské DNA do jaderného genomu - 1990, Blaese a Anderson
- > 2 holčičky s těžkou kombinovanou imunodeficiencí způsobenou chybějící adenosindeaminázou -> inhibuje aktivitu ribonukleotid reduktázy
- > 4letá holčička - velký léčebný efekt a start celé řady klinických studií dalších nemocí
- T-buňky vzaty a přeneseny na tkáňovou kulturu -> stimulace proliferace s IL-2 -> infikováno s retrovirovým vektorem MoMLV-ADA -> injikován zpět do těla
- 1998 - smrt pacienta s defektní ORNITIN TRANSKARBAMYLÁZOU - adenovirový vektor
3
Q
Historie - 1980
A
- pokus o modifikaci lidské DNA, Martin Cline - neschváleno
4
Q
Historie - 1989
A
- úspěšný přenos jaderného genu u lidí -> schváleno
5
Q
Historie - 1990
A
- terapeutické použití přenosu genů + 1. přímé vložení lidské DNA do jaderného genomu - Blaese a Anderson
- > 2 holčičky s těžkou kombinovanou imunodeficiencí způsobenou chybějící adenosindeamidázou -> inhibuje aktivitu rubonukleotid reduktázy
- > 4letá holčička Ashanti - velký léčebný efekt a start celé řady klinických studií dalších nemocí
6
Q
Historie - 1998
A
- Smrt pacienta s defektní ORNITIN TRANSKARBAMYLÁZOU - adenovirový vektor
- Jesse Gelsinger - použití adenoviru jako vektoru, nefungující geny měly být nahrazeny zdravými
- > Výsledek: smrt, nejspíše kvůli vysoké zánětlivé reakci na vektor
7
Q
Genová terapie - Komercionalizace
A
- 1989-2018 - provedeno více než 2900 klinických studií, z nichž 1/2 byla ve fázi I.
- Komerční vývoj startuje kolem roku 2004 v Číně
- > GENDICINE, sarkom krku a hlavy, protein p53
- 2012 - Evropa - GLYBERA -> deficience lipoprotein lipázy
- 2017 - USA - KYMRIAH - > akutní lymfoblastická leukémie odvozena od B-buněk je léčená terapií T-buňkami s chimérickým receptorem antigenu - CAR
8
Q
Přístupy manipulace s genem (4)
A
- Navýšení produkce cílového genomu
- Cílená oprava mutovaného genu -> EDITACE
- Cílená inhibice genové exprese - EDITACE
- Přímé usmrcení poškozených buněk
9
Q
Editace genu (4)
A
- Nukleázy se zinkovým prstem
- > syntetické proteiny, jejichž domény vázají DNA, jim umožní vytvářet doublestrand zlomy v DNA ve specifických bodech - 2009 - Syntetické nukleázy - 2011
- > design a tvorba vlastního proteinu pro každou cílenou sekvenci DNA - RNA interference - RNAi
- CRISPRs
- > syntéza pouze krátké sekvence RNA
10
Q
Editace genu CRISPR/Cas9
A
= Clustered Regularly Interspaced Short Palindromatic Repeats = CRISPR
- bakeriální IS - obrana proti virům
- detekce a odstranění cizího genetického materiálu -> když jsou Prokaryota infikována bakteriofágy, pak fágová DNA vede ke krátkým opakováním klastrů (CRISPR), které se používají k detekci a štěpení fragmentů DNA z podobného typu fágů (adaptivní IS) -> mechanismus nejen pospán, ale i využit - NC 2020
- metoda úpravy CRISPR/Cas9 umožňuje použití gRNA pro identifikaci a štěpení řetězců DNA
- Nukleázové místo přirozené formy (wt) Cas9 specificky štěpí dsDNA a aktivuje dvouvláknové opravné mechanismy
- vývoj zjednodušeného 2-složkového systému spojením TRANS-ACTIVATING CRISPR RNA + CRISPR RNA do jedné dyntetické GUIDE RNA - sgRNA
- druhou složkou systému je NUKLEÁZA CAS9
- pacient s CRISPR editací genu - hemoglobin - srpkovitá anémie
11
Q
Genová terapie - dělení (2)
A
- Zárodečné buňky - zakázané, neetické
- spermie, vajíčka, zárodečné kmenové buňky či raná embrya -> přenos na potomky
- Čína 2018 - Jiankui He - úprava 2 embryí metodou CRISPR -> pokus deaktivace genu pro CCR5 - kóduje receptor, který používá HIV pro vstup do buňky
- odsouzeno jako neetické, dívky si nesly funkční i deaktivované kopie CCR5 = stále zranitelné - Somatické buňky
A) IN VIVO
- transfer genu
- Parkinsonova choroba, Hemofilie B
- CRISPR/Cas9 + HR templát
-> virální přenos - adenovirus, lentivirus, AAV
-> nevirální přenos - lipidové váčky
- INJEKTOVÁNO DO TĚLA
B) EX VIVO (IN VITRO)
- CAR a TCR terapie: Myeloma, Melanoma, Metastázní rakovina
- HSC terapie: Beta-thalesemie, SCID
- odebrány lidské kmenové buňky do in vitro podmínek -> korekce CRISPR/Cas9 -> klonální selekce opravených KB -> expanze -> návrat do těla
- biopsie krve/kůže -> fibroblast -> reprogramování -> CRISPR/Cas9 -> klonální selekce -> expanze -> diferenciace -> návrat do těla
12
Q
Genová terapie - způsoby doručení - Fyzické
A
Fyzické
- nevirové vektory
- Mikroinjekce nahé DNA
- Elektroporace - elektrické pulzy vyvolávají dočasnou depolarizaci plazmatické membrány -> otevření pórů -> pasivní transport -> pak se vlastnosti vrátí do normálu
- Sonoporace - vysokofrekvenční zvukové vlny -> ultrazvuk -> akustická kavitace -> mikropóry a kavitace mikrobublin
13
Q
Genová terapie - způsoby doručení - Chemické
A
- nevirové vektory
- Lipofekce - lipozomy, kationtové lipidy
- Polymery - malá efektivita, dočasný efekt, snadná aplikace i použití, netoxické
14
Q
Genová terapie - způsoby doručení - biologické
A
- virové vektory
- RETROVIRY - obalené RNA viry obsahující reverzní transkriptázu -> virová komplementární DNA má silné promotory a enhancery -> jen proliferující se buňky -> ex vivo
- LENTIVIRY - obalené RNA viry -> odvozeny od HIV1 -> pronikají i do neproliferující se buňky -> lze zacílit na konkrétní typ buněk -> ex vivo
- ADENOVIRY - Neobalené dsDNA viry -> 51 sérotupů u člověka -> exprese p53 a sebevražedných genů
- > očkování proti SARS-CoV2
- HERPETICKÉ VIRY - obalené dsDNA viry -> dlouhodobé přetrvávání
- AAV - neobalené ssDNA viry -> 80 % populace jsou nosiči, přesto nepůsobí žádnou nemoc -> pro replikaci potřebují adenoviry -> způsobují malou imunitní reakci a zjevný nedostatek patogenity -> mohou se integrovat do genomu hostitelské buňky
- > použití pro in vitro genovou terapii
- > mohou cílit na širokou škálu tkání, ale jsou omezeny svou nosností transgenu
- > koinfekce a adenovirem/herpes virem, jeho replikace může být nastartovaná adenovirovými proteiny nebo genotoxickými činidly UV, hydroxyurea
15
Q
Příklady genové terapie (3)
A
= přístup ke změně lidského genomu, který má léčit
- Genetické nemoci
- Virová infekční onemocnění
- Onkologické onemocnění
