Aula 6 Flashcards
Explica a Sequenciação de Sanger
GOLD-STANDARD
É uma reação de PCR com dNTPs e ddNTPs (não têm o grupo OH que reaja com o grupo fosfato do próximo dNTPs - a reação pára quando introduzido) marcados com fluoróforos
1º PCR com DNA polimerase, dNTPs e ddNTPs
2º A reação pára sempre que um ddNTP é incorporado
3º Fragmentos com vários tamanhos são separados em Eletroforese Capilar
4º Os fragmentos passam por um laser que lê o fluoróforo - passa a informação para computador que monta a sequencia de DNA num cromatograma.
Vantagens - Identificação de uma mutação (associada ao fenótipo observado) com alta sensibilidade e especificidade – 99%
Desvantagens - Tempo para análise é muito mais do que para o diagnóstico baseado no PCR em tempo real quantitativo
Aplicações do Sequenciamento de Sanger e quando não deve ser usado
Não é recomendada para diagnóstico quando:
−Este é urgente
−Quando não sabemos que genes estão associados ao fenótipo observado
−Quando o número de genes a analisar é muito grande
−Quando o tamanho de um gene é muito grande, não existem hot spots de mutação e a doença é rara
Aplicações:
−Sequenciação de DNA ou cDNA
−Análise de padrões de metilação
−Análise de microssatélites
−Fingerprinting
Explica o NGS (Next Generation Sequencing)
Conjunto de plataformas que permitem a análise da sequência de várias amostras em simultâneo.
Baseiam-se em 3 passos:
- Preparação da Biblioteca
-Sequenciação
-Análise dos resultados
Tipos de PCR usados para a Preparação de um Biblioteca (NGS)
PCR de fase Líquida - PCR em emulsão - Pirosequenciação ou Sequenciação por ligação
PCR de fase Sólida - PCR em ponte - Sequenciação por síntese
Explica o PCR de fase LIQUIDA (NGS). E dá exemplos.
Pirosequênciação - a mix envolve 3 enzimas:
1º DNA polimerase - sempre que se forma uma ligação fosfodiéster há libertação de PPi e protões
2º ATP-sulfurilase – converte o PPi libertado em ATP
3º Luciferase - reconhece o ATP formado e converte luciferina em oxiluciferina produzindo luz
(Apirase = elimina os restos de dNTPs)
EXEMPLO: Roche 454 (~400-600 Mb por execução)
1º Fragmentação do genoma por nebulização
2º Reconhecimento e ligação dos primers
3º Os fragmentos com adaptadores A e B são selecionados utilizando biotina
4º Na emulsão formam-se cavidades onde estão as esferas
5º Amplificação colonal
6º Sequenciação massiva paralela
Vantagens – Sensibilidade de 99%
Desvantagens – leituras mais longas que levam mais tempo e implicam mais custos
Sequenciação por ligação - EXEMPLO: SOLiD - adição de dNTPs marcados com fluoróforos diferentes, sendo libertada uma cor diferente dependendo do nucleótido adicionado.
Explica o PCR de fase SÓLIDA (NGS). E dá exemplos.
Sequenciação por síntese - São adicionados dNTPs marcados com fluoróforos e é lida a sua fluorescência para determinação da sequência
EXEMPLO: Illumina/Solexa
1º Fragmentação aleatória do DNA genómico
2º Ligação de adaptadores às duas extremidades de cada fragmento
3º Os fragmentos de ssDNA ligam-se aleatoriamente à superfície
4º Amplificação em ponte – adição de nucleótidos e enzimas
5º Desnaturação dos fragmentos de dsDNA
Vantagens – Sensibilidade e especificidade elevadas - precisão superior a 99,5%
Que técnicas de NGS podem ser usadas na prática clinica e o porquê de nem todas poderem ser utilizadas?
Roche 454 e Illumina/Solexa
O grande entrave à utilização das técnicas de NGS é, não só a existência de doenças multifatoriais e a sua variabilidade clínica que aumentam a complexidade da análise dos resultados obtidos, como a falta de conhecimento sobre o nosso próprio genoma. Numa sequenciação obtêm-se n variantes no genoma cujo significado não se conhece, sendo por isso classificadas como variantes de significado desconhecido.
Explica a técnica de NGS Ion Torrent tal como as suas vantagens e desvantagens
Baseia-se na medição do hidrogénio que é libertado de cada vez que um nucleótido é adicionado.
Vantagem - é mais simples que a plataforma Roche, uma vez que não usa 3 enzimas, pelo que pode ser mais rápida.
Desvantagens - as sequências repetitivas são um problema, uma vez que a partir de determinado limite não tem capacidade para medir o número de protões libertados.
Explica a NGS DE 3º GERAÇÃO
−Permitem sequenciar molécula a molécula (sem necessidade de amplificação) - permitindo identificar com precisão as regiões repetitivas.
− Permitem leituras de multi-kilobases facilitariam o estudo de mutações relacionadas que estivessem centenas ou até milhares de bases afastadas.
− A resolução de molécula única permite a caracterização de variações de splicing no transcriptoma
−Tem uma sensibilidade elevadíssima, detetando variantes que estejam presentes em frequências menores que 0,1%
−Deteta e valida SNPs com alta precisão ao evitar erros de mapeamento e de sistema.
−Algumas plataformas já permitem não só sequenciar genomas e transcritomas como também quantificar os últimos e até analisar a estrutura da cromatina, permitindo perceber porque é que determinadas sequências não são transcritas.
Explica os Nanoporos
Mede em tempo real as mudanças na corrente elétrica detetando as moléculas biológicas que passam através do nanoporo ou próximo a ele. − SEM AMPLIFICAÇÃO
Vantagens – Custo e versatilidade
Explica os recursos existentes ao longo dos anos para a NGS
Moore’s Law - O custo de sequenciação têm vindo a baixar
Distingue as tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs)
As tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos podem basear-se em ciclos térmicos, como é o caso do PCR e do qPCR. Ou podem ser tecnologias isotérmicas, como o LAMP, o HCR e o RCA, em que tudo é realizado à mesma temperatura, é mais rápido, envolve menos custos, e menor pressão
Distingue o PCR da tecnologia LAMP
PCR - tem baixa sensibilidade, a reação leva 3-4 horas, utiliza 3 temperaturas ciclicas diferentes, faz a desnaturação por calor, utiliza primers simples
LAMP- tem alta sensibilidade, a reação leva 1h, é isotérmica (60º-65ºC), utiliza um agente de desnaturação enzimático, utiliza primers complexos.
Explica o Point of Care Testing (POCT)
Foram desenvolvidos sistemas portáteis que se baseiam em forças centrifugas e sistemas rápidos de eletrónica. Para permitirem a realização de testes de diagnóstico em locais mais próximos ou nos locais de atendimento a clientes.
Define Nanotecnologia e as propriedades das nanoestruturas
Investigação e desenvolvimento de tecnologias com o objetivo de compreender e controlar matéria e dimensões de aproximadamente 1-100nm, à nanoescala.
Nanoestruturas:
−Os efeitos do tamanho quântico resultam em propriedades mecânicas, eletrónicas, fotónicas e magnéticas únicas dos materiais à nanoescala.
−A reatividade química dos materiais à nanoescala é muito diferente da forma macroscópica (EXEMPLO: ouro à nanoesclaa é inerte e tem cor intensa (nunca há photobleching - apagar) sendo utilizado nos testes rápidos de coviD, e a platina (metais nobres - não são reativos) à nano escala catalisa (muito reativo).
−Grande aumento da área superficial por unidade de massa
−Novas formas químicas de elementos químicos comuns
