Aula 6 Flashcards
Explica a Sequenciação de Sanger
GOLD-STANDARD
É uma reação de PCR com dNTPs e ddNTPs (não têm o grupo OH que reaja com o grupo fosfato do próximo dNTPs - a reação pára quando introduzido) marcados com fluoróforos
1º PCR com DNA polimerase, dNTPs e ddNTPs
2º A reação pára sempre que um ddNTP é incorporado
3º Fragmentos com vários tamanhos são separados em Eletroforese Capilar
4º Os fragmentos passam por um laser que lê o fluoróforo - passa a informação para computador que monta a sequencia de DNA num cromatograma.
Vantagens - Identificação de uma mutação (associada ao fenótipo observado) com alta sensibilidade e especificidade – 99%
Desvantagens - Tempo para análise é muito mais do que para o diagnóstico baseado no PCR em tempo real quantitativo
Aplicações do Sequenciamento de Sanger e quando não deve ser usado
Não é recomendada para diagnóstico quando:
−Este é urgente
−Quando não sabemos que genes estão associados ao fenótipo observado
−Quando o número de genes a analisar é muito grande
−Quando o tamanho de um gene é muito grande, não existem hot spots de mutação e a doença é rara
Aplicações:
−Sequenciação de DNA ou cDNA
−Análise de padrões de metilação
−Análise de microssatélites
−Fingerprinting
Explica o NGS (Next Generation Sequencing)
Conjunto de plataformas que permitem a análise da sequência de várias amostras em simultâneo.
Baseiam-se em 3 passos:
- Preparação da Biblioteca
-Sequenciação
-Análise dos resultados
Tipos de PCR usados para a Preparação de um Biblioteca (NGS)
PCR de fase Líquida - PCR em emulsão - Pirosequenciação ou Sequenciação por ligação
PCR de fase Sólida - PCR em ponte - Sequenciação por síntese
Explica o PCR de fase LIQUIDA (NGS). E dá exemplos.
Pirosequênciação - a mix envolve 3 enzimas:
1º DNA polimerase - sempre que se forma uma ligação fosfodiéster há libertação de PPi e protões
2º ATP-sulfurilase – converte o PPi libertado em ATP
3º Luciferase - reconhece o ATP formado e converte luciferina em oxiluciferina produzindo luz
(Apirase = elimina os restos de dNTPs)
EXEMPLO: Roche 454 (~400-600 Mb por execução)
1º Fragmentação do genoma por nebulização
2º Reconhecimento e ligação dos primers
3º Os fragmentos com adaptadores A e B são selecionados utilizando biotina
4º Na emulsão formam-se cavidades onde estão as esferas
5º Amplificação colonal
6º Sequenciação massiva paralela
Vantagens – Sensibilidade de 99%
Desvantagens – leituras mais longas que levam mais tempo e implicam mais custos
Sequenciação por ligação - EXEMPLO: SOLiD - adição de dNTPs marcados com fluoróforos diferentes, sendo libertada uma cor diferente dependendo do nucleótido adicionado.
Explica o PCR de fase SÓLIDA (NGS). E dá exemplos.
Sequenciação por síntese - São adicionados dNTPs marcados com fluoróforos e é lida a sua fluorescência para determinação da sequência
EXEMPLO: Illumina/Solexa
1º Fragmentação aleatória do DNA genómico
2º Ligação de adaptadores às duas extremidades de cada fragmento
3º Os fragmentos de ssDNA ligam-se aleatoriamente à superfície
4º Amplificação em ponte – adição de nucleótidos e enzimas
5º Desnaturação dos fragmentos de dsDNA
Vantagens – Sensibilidade e especificidade elevadas - precisão superior a 99,5%
Que técnicas de NGS podem ser usadas na prática clinica e o porquê de nem todas poderem ser utilizadas?
Roche 454 e Illumina/Solexa
O grande entrave à utilização das técnicas de NGS é, não só a existência de doenças multifatoriais e a sua variabilidade clínica que aumentam a complexidade da análise dos resultados obtidos, como a falta de conhecimento sobre o nosso próprio genoma. Numa sequenciação obtêm-se n variantes no genoma cujo significado não se conhece, sendo por isso classificadas como variantes de significado desconhecido.
Explica a técnica de NGS Ion Torrent tal como as suas vantagens e desvantagens
Baseia-se na medição do hidrogénio que é libertado de cada vez que um nucleótido é adicionado.
Vantagem - é mais simples que a plataforma Roche, uma vez que não usa 3 enzimas, pelo que pode ser mais rápida.
Desvantagens - as sequências repetitivas são um problema, uma vez que a partir de determinado limite não tem capacidade para medir o número de protões libertados.
Explica a NGS DE 3º GERAÇÃO
−Permitem sequenciar molécula a molécula (sem necessidade de amplificação) - permitindo identificar com precisão as regiões repetitivas.
− Permitem leituras de multi-kilobases facilitariam o estudo de mutações relacionadas que estivessem centenas ou até milhares de bases afastadas.
− A resolução de molécula única permite a caracterização de variações de splicing no transcriptoma
−Tem uma sensibilidade elevadíssima, detetando variantes que estejam presentes em frequências menores que 0,1%
−Deteta e valida SNPs com alta precisão ao evitar erros de mapeamento e de sistema.
−Algumas plataformas já permitem não só sequenciar genomas e transcritomas como também quantificar os últimos e até analisar a estrutura da cromatina, permitindo perceber porque é que determinadas sequências não são transcritas.
Explica os Nanoporos
Mede em tempo real as mudanças na corrente elétrica detetando as moléculas biológicas que passam através do nanoporo ou próximo a ele. − SEM AMPLIFICAÇÃO
Vantagens – Custo e versatilidade
Explica os recursos existentes ao longo dos anos para a NGS
Moore’s Law - O custo de sequenciação têm vindo a baixar
Distingue as tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs)
As tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos podem basear-se em ciclos térmicos, como é o caso do PCR e do qPCR. Ou podem ser tecnologias isotérmicas, como o LAMP, o HCR e o RCA, em que tudo é realizado à mesma temperatura, é mais rápido, envolve menos custos, e menor pressão
Distingue o PCR da tecnologia LAMP
PCR - tem baixa sensibilidade, a reação leva 3-4 horas, utiliza 3 temperaturas ciclicas diferentes, faz a desnaturação por calor, utiliza primers simples
LAMP- tem alta sensibilidade, a reação leva 1h, é isotérmica (60º-65ºC), utiliza um agente de desnaturação enzimático, utiliza primers complexos.
Explica o Point of Care Testing (POCT)
Foram desenvolvidos sistemas portáteis que se baseiam em forças centrifugas e sistemas rápidos de eletrónica. Para permitirem a realização de testes de diagnóstico em locais mais próximos ou nos locais de atendimento a clientes.
Define Nanotecnologia e as propriedades das nanoestruturas
Investigação e desenvolvimento de tecnologias com o objetivo de compreender e controlar matéria e dimensões de aproximadamente 1-100nm, à nanoescala.
Nanoestruturas:
−Os efeitos do tamanho quântico resultam em propriedades mecânicas, eletrónicas, fotónicas e magnéticas únicas dos materiais à nanoescala.
−A reatividade química dos materiais à nanoescala é muito diferente da forma macroscópica (EXEMPLO: ouro à nanoesclaa é inerte e tem cor intensa (nunca há photobleching - apagar) sendo utilizado nos testes rápidos de coviD, e a platina (metais nobres - não são reativos) à nano escala catalisa (muito reativo).
−Grande aumento da área superficial por unidade de massa
−Novas formas químicas de elementos químicos comuns
Porquê bionanotecnologia para o diagnóstico molecular?
A maioria de marcadores biomoleculares são à nano escala – pt, DNA, RNA, etc. Tento em conta que quando o sistema está na mesma escala que a molécula (nano) é muito mais sensível, isto trás várias vantagens para o diagnóstico molecular:
−Aumento da sensibilidade
−Amostras de pequenos volumes
−Tecnologias mais baratas
−Portabilidade – POC
(EXEMPLO: Testes de covid)
Enumera os tipos de Nanotecnologias
−Nanotecnologia em chip: Chips microfluídicos (para volumes de nanolitros) e NanoArrays
−Tecnologias de nanopartículas: Nanopartículas de ouro, Nanobarcodes, NPs magnéticos (ferrofluidos, partículas supramagnéticas para MRI), Tecnologia de ponto quântico
−Tecnologia nanopore
−Imunoensaios baseados em nanopartículas: LFAs (por exemplo Covid)
Propriedades das Nanopartículas
- Magnetismo (com núcleo ou superfície de óxido-metal)
- Ótica (luminescência)
-Pontos de Fusão
-Química superficial (absorção ou reação) - Mecânica (dureza, ductilidade, plasticidade)
-Comportamento metálico
Explica a Ressonância Magnética para o diagnóstico (DMR)
Deteção por potenciometria em que as partículas se movimentam de acordo com o campo e quando o campo é desligado ficam relaxadas permitindo a visualização.
Explica a emissão de luz de pontos quânticos
A emissão de luz em pontos quânticos depende do tamanho em que a diminuição do tamanho das partículas leva a um aumento na energia do band gap que é vermelha quando as partículas são maiores e azul quando são menores.
Define Plasmões Superficiais e distingue SPR (“Surface Plasmon Resonance”) de LSPR (“Localizated Surface Plasmon Resonance”)
Plasmões superficiais (SPs) = oscilações eletrónicas coerentes na interface entre dois materiais
-Ambas baseiam-se na excitação de plasmões superficiais pela luz, ou seja, baseia-se na reflecção de luz por uma superfície de vidro em água.
-Isto depende da frequência de oscilação das moléculas da superfície que, por sua vez, depende do tamanho da superfície. E do desvio desta reflexão por qualquer molécula que esteja na superfície.
-Enquanto que na LSPR se dá numa superficei perfeita em que o angulo de replexão da luz é sempre igual até outras pariculas aderirem, na SPR
Explica as propriedades de absorção de luz das nanopartículas de OURO
-Todas as propiedades dependem da forma das particulas de ouro
-Absorvem em comprimentos de onda visíveis - Normalmente são vermelhas mas quando são de maiores dimensões ficam azuis
-A sua cor deve-se à oscilação coletiva dos eletrões na banda de condução induzida pela luz
- Têm uma forte dispersão óptica
Propriedades das nanopartículas de ouro (AuNPs)
-São fáceis de sintetizar em água
-Não são tóxicas/São biocompatíveis
-Ligam-se a quaisquer moléculas através de ligações sulfureto ou amina -Ótimo para adesão ao DNA e a proteínas
-São quimicamente estáveis.
Explica os métodos de deteção com partículas de Ouro
A detecção é maior quando o ssDNA (mias negativo-adere melhor ao ouro), desta forma podemos determinar se há ou não hibridação com determinadas sondas.
Método Não-Cross-Linking - utiliza nanosondas de ouro:
1º Hibridização das nanosondas com as sequÊncias alvo
2º Adiciona-se sal (aumenta a força iónica).
3º Se as partículas reconhecerem o alvo não há alteração da absorvância da solução – VERMELHO. Se não reconhecerem agregam-se, causando alteração da absorvância – AZUL.
Esta resposta é imediata e tem um nível de sensibilidade elevada.
Método Cross-Linking - a absorvância da solução altera-se se for detetada a molécula-alvo e se ocorrer hibridação das nanosondas de ouro, o linker e a sequência alvo.
É um sistema mais desenvolvido em termos de sensibilidade e performance
Explica a técnica do ouro me papel
Plataforma de papel com nanopartículas de ouro para deteção colorimétrica.
Em que cada ponto no papel funciona como um poço numa placa, ou seja, primeiro há a amplificação da amostra de DNA e depois a hibridização do mesmo com as AuNP dá-se nos poços.
A cor emitida em cada um demostra se houve ou não hibridização.
