Aula 5 Flashcards
Explica a Espetrofotometria de Massa MALTI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desortion/Ionization – Time Of Flight Mass spectrometry)
É uma TÉCNICA DE DIAFNÓSTICO/deteção de doenças conhecidas que possui a sensibilidade do PCR e a precisão da espectrometria de massa. Usa um chip onde podemos identificar 1500 mutações ao mesmo tempo.
1º PCR Multiplex -primers desenhados específicamente
2º Tratamento SAP - limpa os dNTPs com resina
3º Reação iPLEX (2º PCR) - só com um primer que emparelha adjacente à mutação e com ddNTPs
4º Extensão de apenas 1 nucleótido
5º Transferência dos fragmentos de DNA para o chip (imobilizados)
6º O chip é colocado num espectrómetro de massa
7º Migração e a separação dos fragmentos por tamanhos
8º Medição da massa dos fragmentos dá-nos a base que foi estendida
RESULTADOS:
+ Verde -> + Amplificação
- Verde (amarelo) -> - Amplificação
Vermelho -> Não há amplificações (controlos)
Vantagens e Desvantagens da MALTI-TOF
Vantagens – Os reagentes são baratos.
Desvantagens – As mutações têm de ser conhecidas.
Explica a técnica MPA (“Multiple Ligation Probe Amplification”) e as suas vantagens
Permite detetar perdas ou ganhos de REPETIÇÕES utilizando primers com uma região específica de hibridação, uma região stuffer que varia de tamanho distinguindo as sequências, e uma região complementar a primers universais.
1º PCR Multiplex com vários pares de primers para a análise de vários genes ao mesmo tempo
2º Cada par hibrida de forma a que os primers fiquem a uma distância muito pequena um do outro (um em cada extremidade da sequência alvo)
3º Separados por eletroforese capilar
4º Amplificação e quantificação – a polimerase une os primers
5º Os resultados são distinguidos pelo tamanho da região stuffer
- Sendo que, conforme o número de repetições da sequência em estudo vai ocorrer hibridação de mais ou menos primers
Também permite discriminar sequências que diferem num único nucleótido e pode ser usada para detetar mutações pontuais conhecidas.
VANTAGEM - técnica robusta porque utiliza um único par de primers na reação de amplificação
Explica o Droplet Digital PCR e as suas aplicações
- Técnica que torna possível contar moléculas individuais dividindo amostras em ”esferas”, cada uma das quais amplificada usando PCR e digitalizada para fornecer resultados quantitativos absolutos.
(as esferas têm todas o mesmo tamanho e cada uma contêm apenas uma sequência) - Em que cada gota é lida como PCR positivo (1) ou PCR negativo (0) para a molécula de SNA/RNA alvo, assim a análise dos dados é realizada contando as gotas positivas e as gotículas negativas para fornecer quantificação absoluta em formato digital. (+ Florescência -> + Amplificação)
Aplicações:
−Variação do número de cópias
−Deteção de eventos raros
−Deteção de mutação
−Análise de expressão gênica
Diferenças do Droplet Digital PCR para o qPCR
− Resolução quantitativa 10X maior
− Sensibilidade 100X maior
− Custo e tempo de implementação equivalentes
