Aula 3 Flashcards
Diferencia mutação de polimorfismo
A diferença está na frequência com que aparecem na população.
Enquanto que as mutações são raras, ou seja, apenas aparecem em menos de 1% da população. Tudo o que for mais frequente que isso é considerado um polimorfismo.
(dependendo sempre da população que se está a considerar)
Tipos de amostras biológicas
−Sangue Periférico (EDTA / heparina):Soro / plasma, Glóbulos brancos
−Medula Óssea
−Células Epiteliais
−Culturas primárias
−Outros fluídos corporais (fluído amniótico, sémen, urina)
−Tecido: Fresca/congelada, Parafinas o Cabelo (células da raiz do cabelo)
De que formas pode ser conservado o sangue ou a medula óssea?
-Agentes anticoagulantes, com Ca2+ que inibe a cascata que leva à coagulação e libertação de hemoglobina que não permite análises em condições: como EDTA (usado na biologia molecular; forte agente quelante de iões bivalentes) ou heparina (usada em citogenética; não é usado em biologia molecular porque interfere com a DNA Polimerase e, como tal, não pode ser usada numa amostra que irá sofrer PCR);
-Misturas que evitem a lise celular.
-conservação em FTA, um papel que permite o armazenamento durante muito tempo; importante, preencher, pelo menos, 3 círculos com o sangue do paciente; permite conservar a amostra à temperatura ambiente.
-Congelamento com separação prévia das células nucleadas das não nucleadas, por centrifugação a baixa rotação - para extração de DNA -80ºC para longos períodos (não recomendado) ou a 2-8ºC em menos de 72h (armazenamento a -20ºC não recomendado)
-RNA latter para quando é pretendida extração de RNA e permite a durabilidade do RNA por 12 dias a 18-25ºC ou 14 dias a 2-8ºC, sem a necessidade de separação prévia das células (a amostra deve ser colocada nesta solução logo na altura da recolha)
De que formas podem ser conservados tecidos?
Os tecidos podem ser conservamos embebidos em parafina - Fixação em formalina neutra ou paraformaldeído que ao contrário do mercúrio e de outros metais, não destrói os ácidos nucleicos.
Fatores importantes para a seleção da metodologia adequada para extração de DNA/RNA
−Velocidade de processamento
−Facilidade de uso
−Rendimento de DNA e RNA
−Qualidade dos ácidos nucleicos (tem implacto na performance da amplificação) −Armazenamento
−Segurança de qualidade
−Custo
Métodos para extração de DNA
Fase Líquida:
1.Separaçaõ dos glóbulos brancos
2.Lise das células
3.Digestão proteica com Proteínase K (ProK)
4.Separação das proteínas do DNA
5.Precipitação do DNA (álcool)
6.Rehidratar o DNA
Fase Sólida:
1.Pré-lise dos glóbulos brancos
2.Aplicação da amostra numa coluna
3.Lavagem
4.Eluição do DNA
Aplicações do DNA no diagnóstico na Medicina Genética
−Amplification (PCR)
−Digestão com enzimas de restrição
−Técnicas de Hibridação (eg. Southern blott, microarrays)
−Sequensição
Passos fundamentais para a extração de RNA
1.Separação dos glóbulos brancos (WBCs = white blood cells)
2.Lise das células (evitando RNases e agentes desnaturantes de proteínas)
3.Separação das proteínas, DNA e outros detritos celulares
4.Precipitação do RNA
5.Resuspender em água com dietilpirocarbonato (DEPC)
Precauções a ter na extração de RNA
−O RNA é uma molécula instável, sendo facilmente degradado por RNases
−Utilizar material laboratorial previamente esterilizado
−Usar sempre luvas
−Tratar todos os materiais com DEPC
Aplicações do RNA no diagnóstico na Medicina Genética:
−Amplificação (RT-PCR)
−Quantificação (qPCR)
−Técnicas de Hibridização (microarrays)
Tipos de mutação e a sua relação com certas patologias
-Mutações de substituição são, na sua maioria, silenciosas, porque o aminoácido adicionado no polipéptido é o mesmo
- Mutações que leva à introdução de um aminoácido diferente - pode ou nõa ter um impacto na função da proteína formada
-Mutação que cria um codão-STOP permaturo - leva à terminação precoce da tradução - pode ou não levar à perda funcional da proteína
- Mutações de Inserções e Deleções - levam à introdução de muitos aminoácidos diferentes - afeta as funcionalidades da proteína
-Mutações associadas ao aumento ou à diminuição no número de repetições - associadas maioritariamente a patologias
Que regiões nõa codificantes podemos encontrar no nosso genoma? Que utilidade têm estas regiões?
−microssatélites (repetições de 2-3 nucleótidos em tandem, ou seja, umas a seguir às outras em módulos/grupos),
−minissatélites (repetições de 10-100 nucleótidos em tandem)
−satélites (repetições de grandes sequências não em tandem, ou seja, as repetições estão espalhadas pelo genoma).
Permitem a identificação de indivíduos – testes de paternidade.
Métodos de Amplificação
−PCR (standart, multiplex, ARMS, ASO, OLA, Nested)
−RFLP
−Multiple Ligation Probe Amplification (MLPA) – baseia-se em hibridação e amplificação por PCR, seguida de uma análise de fragmentos numa eletroforese ligada a um sequenciador para deteção do número de cópias de um gene – associado a deteção de doenças causadas por ganhos ou perdas de cópias de genes.
-SSCP (single strand conformation polimorphism)
−DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)
− TGGE (temperature gradient gel electrophoresis)
−Sequenciação - é sempre necessário sequenciar as duas cadeias de DNA, porque as polimerases podem cometer erros; é uma técnica de diagnóstico.
−dHPLC (cromatografia de alta resolução em condições desnaturantes)
−PCR em tempo real – variantes deste método são usadas para análise de expressão genética ou deteção de mutações; ex: HRM (High Resolution Melting)
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−Microarrays de DNA ou RNA
−Nanopartículas – permitem aumentar muito a sensibilidade do diagnóstico e podem ser dirigidas a locais específicos (tecidos, organelos) do organismo, desde que tenham associadas moléculas que lhes permitam atravessar membranas celulares ou organelares.
Distingue os diferentes tipos de PCR
(PCR, Multiplex, RFLP, ASO, ARMS, Nested)
PCR - Baseia-se na capacidade das DNA Polimerases e dos primers (forward e reverse) para replicar o DNA e aumentar a amostra disponível para posterior análise - trabalhoso e moroso - por isso, analisar apenas regiões hotspot de mutação permitindo desde logo confirmar ou excluir essas mutações mais prováveis de uma forma rápida
PCR Multiplex - utiliza + de 2 primers na mesma reação, amplificando mais do que um único fragmento de DNA numa única reação. Precisa de garantir que:
-as regiões cobertas por cada par de primers estão relativamente afastadas umas das outras para não diminuir a especificidade,
-o que não emparelham intraprimers (com os iguais), interprimers (com os diferentes) ou com o próprio (formação de hairpin)
-o que o tamanho dos amplicões é diferente entre eles para que possam ser separados por eletroforese
PCR-RFLP - baseada na utilização de enzimas de restrição específicas de uma sequência alvo (endonucleases do tipo I) em que se ocorrer uma mutação no local de corte de uma enzima esta deixa de o reconhecer e deixa de catalisar a reação de hidrólise e vice-versa. E envolve a análise dos fragmentos por eletrofor - adequado para genes com baixo número de mutações conhecidas
PCR ASO (allele specific amplification) - Baseia-se no uso de oligonucleótidos específicos de alelos, o normal e o mutado, como primers e analisa se há ou não amplificação da amostra com cada par de primers - substituição do RFLP
PCR-ARMS - Semelhante ao ASO, mas para além de primers complementares aos alelos normal e mutante, utiliza também primers externos que ladeiam a zona afetada - substituto do RFLP - mais especifico
PCR Nested - utiliza 2 conjuntos de primers – externos e internos - e é divido em 2 PCRs um para cada par de primers -
mais especifico e origina maior quantidade de amplificado.
