Aula 2 Flashcards
Passos para a visualização do Cariótipo?
- Colheita de sangue
- Adição de fitohemaglutinina para estimular os linfócitos
- Cultura a 37ºC durante 3 dias
- Adição de sais hipotónicos para se dar a lise celular
- Adição de colchicina que interrompe a divisão dos linfócitos na Metafase (estado de condensação máxima dos cromossomas) ao ligar-se aos microtúbulos
- As células são fixadas a uma lâmina sob um ambiente de laboratório altamente controlado
- Espalham-se as células gotejando
- Adição de Tripsina para digestão das membranas celulares
- Adição de Giensa para corar as células
- Análise
- Formação do cariótipo
Tipos de técnicas de marcação em bandas
Bandas com G (Giensa) – Método mais usado. Os cromossomas são tratados com tripsina para desnaturar o seu conteúdo proteico, e corados com Giensa que se liga ao DNA, criando um padrão de bandas escuras e claras, em que as regiões ricas em G-C (eucromatina), ricas em genes, ficam mais escuras.
Bandas com Q (quinacrina – corante fluorescente) – semelhante ao Giemsa mas deve ser observado ao microscópio de fluorescência.
Bandas R (reversas) – Cromossomas são desnaturados por aquecimento antes de serem corados com Giemsa, criando bandas com o padrão oposto ao do Giemsa habitual. Ou seja, as regiões ricas em AT (heterocromatina), pobres em genes, ficam mais claras.
Bandas em C (heterocromatina centromérica) – tratamento de cromossomas com ácido seguido de base antes da adição do Giemsa. O centrómero e as regiões heterocromáticas que contêm sequências repetitivas são coradas preferencialmente. Pouco utilizado.
Técnica FISH
(Fluorescence in situ Hibridization) Baseia-se em sondas de DNA marcadas com fluorocromos que hibridadam com os cromossomas durante a metáfase ou com o núcleo durante a interfase para localizar sequências específicas no genoma
Tipos de sondas
Corantes (“Painting”) – coram o cromossoma inteiro para identificação de trissomias, translocações de genes entre cromossomas, perdas de cromossomas (apenas podemos perder um X ou um Y – nada mais é compatível com a vida)
− Centroméricas – coram o centrómero; menos utilizada
− Específicas de sequência/ do locus – coram apenas a sequência-alvo – deteção de deleções e translocações
− Teloméricas – coram os telómeros para deteção de microdeleções/microduplicações e translocações subcríticas; (identificação de casos de atraso mental idiopático, i.e. aqueles casos que antes não se sabia bem a causa, por não estarem associados a síndromes, percebeu-se que por vezes (5%) estavam associados a perdas de regiões teloméricas e passou-se a usar estas sondas para identificar estes casos).
Para que servem as combinações de sondas? E que tipos de combinações existem?
(Dá exemplos)
Servem para analisar síndromes específicos, como o Síndrome de Prader-Willi/Angleman.
E podem ser:
-Sondas de single fusion- sondas com cores diferentes para cada gene (que estão em cromossomas diferentes) envolvido na translocação; se ocorrer translocação, as sondas irão surgir no mesmo cromossoma.
- Sondas break apart- sondas com cores diferentes para as duas partes de um mesmo gene envolvido na translocação; se ocorrer translocação, as duas sondas afastam-se.
Para que serve a Hibridização Genómica Comparativa (CGH) ?
(Explica o processo e as limitações)
Serve para obter metáfases de boa qualidade em preparações de tumores sólidos, sendo que apenas consegue detetar alterações no número de cópias de genes.
Através de:
1. o DNA tumoral é marcado com um fluoróforo vermelho e o DNA controlo com um verde.
- Os dois são, então, hibridados com cromossomas em metáfase normais. Desta forma:
a. se a amostra tumoral tem mais DNA que o controlo (resultante de duplicações) há um aumento da intensidade da fluorescência vermelha.
b. se o DNA tumoral tiver antes deleções, há mais fluorescência verde.
c. se houver a mesma quantidade de DNA a fluorescência resultante é a mistura das duas – amarela. - os DNAs utilizados são fixados numa lâmina de vidro.
Limitações - tem baixa resolução
Para que serve a técnica Array-CGH?
(Explica o processo)
Deteta o número de cópias de variações (genes e regiões), elimina os cromossomas em metáfase e trabalha com fragmentos do cromossoma (e nunca com o cromossoma completo).
Em cada um dos poços estão moléculas alvo (sondas), que são oligonucleótidos (primers) das regiões que queremos estudar do genoma, com que vão hibridar fragmentos do DNA tumoral e do DNA de referência.
Relação entre a CGH e a Array-CGH.
A Array-CGH tem maior sensibilidade que o CGH, uma vez que cada região do genoma está melhor delimitada e permite perceber melhor onde houve ganhos ou perdas de DNA.
Desvantagens em comum: requerem leitores de fluorescência e requerem mais do que uma cópia de cada região para garantir que o resultado é fiável. Para além disso, tem que se garantir que o DNA da amostra está puro.
