Aula 4 Flashcards
Quais são técnicas alternativas ao PCR? Distingue-as
LAMP = Amplificação isotérmica com vários pares de primers que formam loops fazendo com que a sequência entre eles seja amplificada na mesma molécula - a amplificação ótima envolve o uso de 6 primers
RPA = Amplificação Recombinase Polimerase - entre os 37º-42º utiliza 3 proteínas: a Recombinase (cria um complexo com os primers), a single stranded DNA binding protein SSD (estabiliza a ligaçaõ do complexo ao DNA) e a Polimerase strand-displacing que polimeriza o DNA - amplificação específica e rápida - pode ser multiplexada
RCA = rolling circular amplification -
Explica o PCR em Tempo Real (qPCR)
- Baseia-se em sistemas de deteção de florescência em tempo real através de ciclos térmicos.
- É realizado na presença de um fluoróforo que dá sinal (florescência) conforme o produto é amplificado, pelo que é necessário que o termociclador (máquina de PCR) possua um detetor de fluorescência. Permitindo monitorizar/acompanhar ao longo do tempo a reação de PCR.
- Permite a quantificação da quantidade inicial de DNA/RNA.
-O que se observa não é o resultado final, mas sim o treshhold de amplificação, ou seja, a duração da fase de lag - a duração da fase de lag é inversamente proporcional à concentração do material - A deteção pode ser absoluta (é necessária uma curva de calibração) feita a partir dos treshholds obtidos com amostras de concentração conhecida, ou pode ser relativa em que tem de haver um gene housekeeping que vai normalizar a quantidade de DNA .
Compara o PCR com o PCR em Tempo Real.
PCR - Menos resultados, Deteção do produto no fim do PCR (Para ver o resultado final, necessito de um gel), Na hibridização usa apenas primers, Permite realizar genotipagem (descriminação alélica, deteção de SNPs, mutações pontuais, inserções e deleções)
qPCR - Resultados mais complexos e sensíveis, Deteção do produto a ser amplificado durante a reação, Na hibridização usa sondas e primers, Permite obter quantificação absoluta e relativa, Permite realizar genotipagem
Quais são os sistemas qPCR de deteção? Distingue-os.
SyBr green – Ligam-se ao minor Groove do dsDNA de forma inespecífica de sequência na fase de EXTENSÃO e emitem florescência que é proporcional ao crescimento da molécula de DNA - desvantagem: basta ter um fraguemento de DNA (contaminação) para ser emitida florescência e haver interferência com os resultados.
Sondas de Clivagem – TaqMan - são constituídas por um fluoróforo repórter na extremidade 5’ e um fluoróforo quencher na extremidade 3’ que suprime a florescência do repórter quando junto a ele. É na fase de EXTENSÃO que a DNA polimerase ao amplificar a sequência cliva a sonda permitindo a emissão de florescência.
Sondas deslocáveis - Molecular Beacons - sonda em forma de hairpin loop complementar à sequência alvo com um fluoróforo repórter na extremidade 5’ e um fluoróforo quencher na extremidade 3’. É na fase de ANEALING que a sonda ao ligar-se ao DNA separa as sondas e permite a emissão de florescência. - DESVANTAGEM: deteção devido a degradação das sondas e interações não específicas
Sondas deslocáveis – FRET - 2 sondas R1 e R2 (um aceitador e um dador de florescência) com um fluoróforo cada uma com florescências em diferentes zonas do espectro (emitem cores diferentes). É na fase de ANNEALING que as sondas ao ligar-se à sequencia alvo se unem e emitem florescência. - Técnica mais sensível e mais cara
Sonda deslocáveis – Dual FRET Molecular Beacons - 2 sondas em estrutura de hairpin loop cada uma com um quencher: uma delas com um fluoróforo dador e outra com o aceitador. - mais sensível - evita os probelmas das Beacon e mantém as qualidades das FRET
Vantagens e Desvantagens do qPCR
Vantagens:
−Simples e rápido
−Específico e sensível
−Amplificações a partir de pequenas quantidades
−Flexível
Desvantagens – equipamentos e rearranjos caros
Explica a técnica HRM (High Resolution Melting)
-Permite identificação de mutações/SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) novos ou conhecidos (inserções, deleções, alterações de bases) -TÉCNICA DE RASTREIO - PCR seguido de rampas de temperatura (PERFIS DE MELTING - dependem do conteúdo GC da amostra)
1º qPCR com SyBr® green - são amplificados 2 alelo – um normal e outro mutado
2º durante a polimerização temos fluorescência no máximo
3º ocorre a desnaturação, as cadeias separam-se e a fluorescência cai a pique
4º reanealing rápido, mas apenas de regiões altamente complementares:
- Heteroduplexes - têm mutações - menos florescência porque os locais de mutação não são hibridados então há menos fluroforos intercalados
- Homoduplexes - sem mutações - mais florescência
5º A temperatura é aumentada ligeiramente para que ocorra desnaturação de novo:
- Primeiro desnaturam os heteroduplexes porque têm menos fluroforos, ou seja, vão sempre perder da fluorescência mais rapidamente porque têm um perfil de melting muito distinto dos homozigóticos
- Em último desnaturam os homozigóticos
Vantagens da HRM
- Evita Sanger em regiões desnecessárias.
- Tem alta sensibilidade e especificidade,
- É capaz de detetar alterações heterozigóticas e homozigóticas,
- Reprodutíveis,
- Rápido (2h)
- Num único tubo
- Consumíveis baratos para detetar variações no DNA.
Explica a técnica dHPLC (“Denaturating High Performance Liquid Chromatography”)
TÉCNICA DE RASTREIO - permite detetar mutações pontuais, pequenas mutações e inserções em genes múltiplos com múltiplas mutações SEM usar de floróforos
1º qPCR
2º Desnaturação do produto (aumento da temp)
3º Renaturação (diminuição lenta da temp)
4º Formação dos heteroduplexes e/ou homoduplexes
5º Colocado numa coluna de cromatografia, cuja matriz está carregada positivamente
6º Os fragmentos de DNA fique retido na coluna
7º Eluição do DNA com um solvente orgânico
8º Os heteroduplexes (com mutações) serão sempre os primeiros a sair por serem mais instáveis e terem menor afinidade para a coluna
9. Com um detetor de UV é medida a absorvância
Vantagens e Desvantagens da técnica dHPLC
Vantagens:
−É um método muito sensível e específica (96-100%)
−Permite detectar mutações pontuais, pequenas deleções e inserções em múltiplos genes com múltiplas mutações.
Desvantagens:
- Não se consegue distinguir os homoduplexes mutantes dos WT
−É um método apenas semi-automático
−É uma técnica laboriosa, consumidora de tempo e cara
