Analytique Flashcards
Quel est le calcul de la loi de Beer-Lambert?
A=abc
a : coefficient d’extinction molaire
b: longueur de la trajection de la lumière
c: concentration de l’échantillon
Quelle est la relation entre l’absorbance et la transmittance?
La concentration d’une substance (proportionnelle à la quantité de lumière absorbée) = inversement proportionnelle au logarithme de la lumière transmise
A = -log Is/I0 = -logT
Est-il préférable d’avoir un coefficient d’extinction molaire bas ou élevé et pourquoi?
-Préférable d’avoir un coefficient d’absorption molaire élevé puisque plus il est grand et plus la linéarité est longue
-Ça permet de déterminer une concentration plus précise de la solution
-Ça peut permettre d’éviter de diluer les échantillons pour plus longtemps
Quel technique peut-il être utilisé en spectrophotométrie pour éviter la présence de mesures de réactions non spécifiques?
Il est possible de prendre nos données à un temps spécifique (ex: entre 10 et 20 sec) dans lequel il n’y a pas de réactions non spécifiques.
Dessine moi un spectrophotomètre à un seul rayon.
Notes de la prof:
1) source de lumière
2) façon d’isoler la λ (monochromateur)
3) fibre optique
4) cuvette (cellule d’absorption)
5) photodétecteur (convertit énergie de la lumière en énergie électrique)
6) détecteur
7) enregistreur de données
8) ordinateur
Dessine moi un spectrophotomètre à double rayons.
Spectrophotomètre double faisceau dans l’espace (double-beam-in-space)
ou
Spectrophotomètre double faisceau dans le temps (double-beam-in-time)
Nomme trois façons d’isoler un spectre.
-Filtres
-Prismes: sépare la lumière blanche en un spectre continu par réfraction
-Gratings (grillage) de diffraction: dépôt d’une mince couche d’un alliage de cuivre-aluminium sur une surface de verre plat rainurée (1000-2000 lignes/mm), principe: chacune des lignes génère un petit spectre donc celles en phase se renforcent et les autres s’annulent, donne donc un spectre continu
Illustre le principe d’un photomultiplicateur.
1) lumière arrive à photocathode (photon convertit en électron)
2) circuit de dynodes qui augmentent le nombre d’électrons, différence de potentiel croissante entre chaque dynode
3) anode : électrons détectés
*amplifie un photon en 10^7 électrons
Quels sont les inconvénients (les interférences) d’un photodétecteur?
-Lumière parasite (radiation de la longueur d’onde à l’extérieur de la bande étroite par dispersion et diffraction)
-Fluorescence potentielle de l’échantillon
Dessine moi la photométrie de réflectance et indique moi les avantages et désavantages
-Avantages-: simple, rapide, peu coûteux
-Désavantage : peu précis, l’intensité de la lumière n’est pas linéaire
Qu’est-ce que la spectrophotométrie de flamme et quels sont les avantages et désavantages? Dessine le.
-Principe: Émission de la lumière par les atomes de plusieurs éléments métalliques. Les métaux émettent dans des longueurs d’onde spécifiques lorsqu’on leur donne assez d’énergie. Les couleurs des métaux sont caractéristiques des atomes présents dans un échantillon. Technique de référence, mais peu utilisé de nos jours.
-Avantages : certains éléments sont analysés avec moins d’interférence
-désavantage : Pour l’analyse des alcalins et c’est assez coûteux
Dessine moi avec ces composants le principe d’un fluoromètre. Quels sont ses avantages et inconvénients?
-Avantages : sécuritaire (évite radio), essais homogènes, automatisée, rapide, sensible
-Désavantages : Certaines substances (drogues et ses métabolites) et autres molécules (ex : bilirubine) font de la fluorescence interférente, limité à 20kDa
Qu’est-ce que la fluorescence en temps différé? Donne moi un exemple.
-Fluorescence en temps différé : Échantillons marqués avec fluorophore avec longue demi-vie. De ce fait, la lumière mesurée est celle qui persiste lorsque les émissions non spécifiques des autres surfaces et matériaux s’éteignent. Mesure du déclin du signal de fluorescence après excitation.
-Exemple : DELFIA pour dépistage néonatale
Qu’est-ce que la fluorescence polarisée? Nomme des avantages et inconvénients.
-Fluorescence polarisée : Fluorophore absorbe plus efficacement dans les plans de ses niveaux d’énergie électronique – importance de la taille de la molécule – rotation de la molécule – on déterminer la durée moyenne de l’état d’excitation de la molécule (plus molécule grosses, et plus est élevé, + rotation est longue) – Plus rotation est longue et plus lumière reste polarisée- si lié à anticorps il y a réémission de lumière polarisé.
-Avantages : sensible, rapide, homogène, automatisée, réactifs stables
-Inconvénient : Instrumentation spécialisée, dédié au FPIA, kDa doit être plus petit que 20, pour drogues et médicaments.
Limites de la fluorescence.
-Effet de filtre intérieur (lorsque concentration de l’échantillon et fluorescence n’est plus linéaire)
-concentration quenching (plus faible fluorescence à cause d’une faible distance entre fluorophore et molécule d’intérêt)
-dispersion de lumière
-effet de la cuvette de solvant
-effet de matrice
-température (intensité de la fluorescence diminue avec l’augmentation de température)
-photodécomposition (diminution fluorescence à cause de lumières intenses)
Qu’est-ce que la chimiluminescence et donne moi un exemple.
-Chimiluminescence : Émission de lumière lorsqu’une molécule (électrons) possédant une énergie élevé (ou excité) devient basse. L’excitation est causée par une Rx chimique qui implique l’oxydation d’un composé organique (ex: luminol, isoluminol, les esters d’acridinium, la luciférine) par un oxydant (oxygène, peroxyde d’hydrogène, hypochlorite). Nécessite catalyseurs comme des enzymes (ALP) ou des ions/complexes métaliques (Cu2+, Fe2+)
-Exemple en immunologie : anticorps/haptènes liés à molécules luminescentes, lorsqu’antigène se lie à l’anticorps marqué, réaction de chimiluminescence, donc intensité lumière proportionnelle à conc échantillon (peut avoir background ou fuite de lumière)
Qu’-est ce que l’électrochimiluminescence?
Rx générée par des précurseurs stables à la surface d’une électrode (ex ruthenium tris(bipyridyl) chélaté fait une Rx oxydo-réduction avec tripropylamine)
Indiquez des facteurs qui influencent une réaction enzymatique.
-Concentration de l’enzyme (principe de base: vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration d’enzyme)
-pH (faire attention aux dilutions qui peuvent affecter la réaction vu diminution des cofacteurs)
-Température
-Molécules inhibitrices
Dans un graphique de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat, comment on calcule le Km?
Km = 1/2Vmax
Vmax se détermine avec le plateau de la courbe.
Un graphique de la vitesse de Rx en fonction de la concentration du substrat donne une courbe qui atteint un plateau. Lorsqu’on transforme cette courbe pour obtenir une droite, on fait un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]. Dans ce dernier graphique, que représentent l’abscisse et l’ordonnée à l’origine?
intersection avec axe des x (abscisse à l’origine) = -(1/Km)
intersection avec axe des y (ordonnée à l’origine) : 1/Vmax
Quel est l’effet des différents types d’inhibiteurs sur la droite dans un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]
-inhibiteur compétitif
-inhibiteur non compétitif
-inhibiteur “uncompétitif”
-inhibiteur compétitif : Km augmente et Vmax n’est pas affecté (pente plus à pic)
-inhibiteur non compétitif : Km n’est pas affecté et Vmax diminue
-inhibiteur “uncompétitif” : Km diminue et Vmax diminue
Quelle est la relation de la vitesse et de Km dans la portion linéaire d’une droite (là ou il faut prendre les mesures d’une analyse) ?
v = Km
Indiquez 2 méthodes d’analyse en enzymologie.
-Point final : Tout le substrat est transformé en produit par la réaction analytique
-Mode cinétique : Changement absorbance par unité de temps, spectro et chrono précis, cinétique initiale d’ordre 1 (vitesse proportionnelle à la concentration)
Nomme un inconvénient de la méthode point final
Inconvénient : temps réaction plus long pour une réaction complète
Indiquez des éléments à faire attention lorsqu’on fait une calibration à un facteur
-effet du pH
-température
-force ionique sur le coefficient d’absorption molaire
Indiquez 3 éléments qui font de l’interférence avec des réactions enzymatiques et quelles sont des pistes de solutions pour corriger ces interférences, lorsque possible.
Interférences:
-Turbidimétrie (lactescence/lipémie, protéines, précipité)
-Bilirubine (ictère)
-Hémolyse
Solutions:
-mesure à deux longueurs d’onde
-facteur de correction
Qu’est-ce que l’EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique)?
1-Anticorps + analyte sont mélangé et la liaison se fait
2-Ensuite, on ajoute d’un enzyme lié à l’antigène (même chose que l’analyte)
3-Les anticorps en excès vont lier l’enzyme-antigène, ce qui va diminuer l’activité de l’enzyme.
4-Mesure de l’Activité de l’enzyme (si + activité enzymatique dans échantillon donc, + analytes du patient (homogène))
Qu’est-ce que le CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay)?
1-Les Ac et le fragment donneur de l’enzyme (b-galactosidase) sont liés. L’Ac bloque la dimérisation et ainsi son activité.
2-L’ajout de l’antigène déplace le fragment donneur de l’enzyme et lie l’Ac.
3-Le fragment donneur est libéré, ce qui permet l’assemblage des deux fragments de l’enzyme et active l’enzyme.
*Si antigène présent en grande quantité, l’activité de la beta-galactosidase est maximale.
Pourquoi c’est important de calibrer une réaction enzymatique?
Pour faire la comparaison avec les pairs. Pour établir des valeurs cliniques comparables (ex: 2-3x la limite supérieure normale = problème)
Qu’est-ce qui est principalement dosé en ICP-MS?
-éléments traces (ex : cuivre, fer, fluor, manganèse, zinc) (250ug/g matrice)
-éléments ultratraces (arsenic, chrome, molybdène, nickel, sélénium, silicone, vanadium) (moins ug/g matrice)
Pourquoi regarder les éléments essentiels?
-nutrition parentérale
-absorption gastro-intestinale
-histoire d’exposition aigue ou chronique
-maladie génétique (Ex : Wilson)
-protéases orthopédiques
Dans quelles situations rechercher des métaux toxiques?
-maladie rénale idiopathique
-neuropathie périphérique bilatérale
-changement rapide de la fonction mentale
-inflammation aigue de la muqueuse nasale ou du larynx
-histoire d’exposition
Comment traiter les intoxications?
-Enlever la source décontamination du G.I. (ex :lavage)
-augmenter l’élimination (ex: chélateur acides biliaires tel que cholestyramine)
-traiter avec antidotes (ex: déféroxamine)
Qu’est-ce qui est possible de doser en complément avec les éléments?
-protéines de transport souvent aussi regard lors de dosage avec l’élément (comme transferrine pour le fer)
-regarder créatinine si urinaire.
Nomme moi deux types d’absorption atomique
-Spectrométrie d’absorption atomique à flamme -spectrométrie d’absorption atomique par four graphite
Quels sont les étapes de l’AAS général?
-échantillons en vapeur d’atomes libres
-– mesure absorption d’une lumière à longueur d’onde caractéristique à chaque élément
-– absorption proportionnelle à la concentration d’atomes libres dans le trajet du rayon lumineux.
Quels sont les composants d’un AAS à flame?
-Lampe (spécifique pour chaque élément à doser et émet spectre de ligne de l’élément à doser
-atomiseur (échantillons liquides en atome libre)
-monochromateur (isole raie de résonance)
-détecteur
-amplificateur et système d’analyse des données
Comment fonctionne le principe de l’AAS à flame?
Lampe
-nébulisateur (aspire échantillon) + brise jet/bille d’impact fractionne échantillons (élimine grosse gouttelettes (puisque serait pas capable de les rendre en atome libre vu courte exposition à la flamme) pour rester les petites gouttelettes
-Petites gouttelettes vont entrer dans la chambre ou le mélange des gaz est fait
– Brûleur (flamme) air/acétylène (2300 C) ou air/oxyde nitreux (2900C) pour doser éléments présents en concentration minimale (mélange avec échantillon)
pourquoi utiliser de l’AAS au four?
Plus sensible et complexe avec atomisation électrothermale
-Utilisé lorsque concentrationdu volume trop faible pour la technique à flamme.
Étapes de l’AAS au four?
Échantillons déposés – séchage- décomposition – atomisation – pyrolyse
Comment diminuer les interférences de matrice causé par l’AAS au four?
-Lors d’atomisation, possible d’ajouter un modificateur de matrice qui va retenir l’élément à analyser à une température plus élevée
– va uniformiser l’espèce chimique de l’élément à mesurer et facilite l’élimination des autres substances de la matrice pendant le traitement thermique de l’échantillon
Permet d’avoir des conditions facilement reproductibles de traitement chimique + atomisation et permet d’éviter des pics de d’autres éléments.
Avantages et inconvénients de l’AAS au four?
Avantages :
-Tout échantillon atomisé
-atomes + longtemps dans le trajet
-100-1000 fois plus sensible que la flamme
Désavantages :
-analyse est plus longue
-interférence chimique plus grande de la matrice
Comment aider à éviter l’effet de matrice pour l’AAS au four?
-on fait étalonnage souvent avec ajouts dosés
-Fait la courbe à partir des échantillons qui vont être analysé (spike l’échantillon pour faire la courbe)
Nomme moi les différents interférences pour l’AAS
-Interférence chimique
-Ionisation
-Interférence de la matrice
-Interférence d’émission
-Interférence spectrale
-Absorption du fond
Qu’est-ce que l’interférence chimique pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Liaison de certains métaux à d’autres espèces chimiques pour former molécules stables qui résistent à dissociation par flamme – réduit le nombre d’atomes libres dans la flamme et ainsi diminue absorbance
- Solution : augmenter température flamme ou addition élément libérateur (ex : Phosphate + calcium forme composé – ajout de bcp de lanthane éliminant interférence des phosphates sur calcium
Qu’est-ce que l’interférence d’ionisation pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Température flamme ou four fournit assez d’énergie pour enlever un électron d’un atome
– production d’un ion + qui n’a pas les mêmes lignes d’absorption que l’atome neutre
-– réduit nombre d’atomes libres neutres dans la cellules d’absorption et ainsi diminue absorbance.
-Solution : ionisation d’un élément réduit par l’ajout en grande quantité d’un autre élément plus facilement ionisable (Na ou K)
Qu’est-ce que l’interférence de matrice pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Causé par différente viscosité ou tension entre étalon et échantillons à cause des différences de concentration d’autres substances ou nature du solvant
-change vitesse d’aspiration des solutions et les caractéristiques de combustion
-Faut rendre étalon le plus similaire possible à l’échantillon
Solution :
-tout réactif ajouté dans les préparations des échantillons doit l’être dans les étalons
-une dilution importante des échantillons rend l’interférence négligeable
-si interférence persiste utiliser méthode des ajouts dosés (au moins 3 mesures par échantillon)
Qu’est-ce que l’interférence d’émission pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Précision analytique peut être compromise dans la flamme lorsqu’un élément à concentration élevée émet fortement dans la bande spectrale passante.
-Solution :
-diminuer largeur de la fente du monochromateur
-diluer échantillon ou changer la longueur d’onde pour mesure l’AA avec perte de sensibilité
Qu’est-ce que l’interférence spectrale pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-causée par un élément de la matrice dont la longueur d’onde d’absorption tombe à l’intérieur de la largeur du raie d’absorption de l’élément dosé résultant une fausse élévation des résultats.
Solution :
-Changement de la longueur d’onde pour l’absorbance atomique mais avec baisse de sensibilité.
Qu’est-ce que l’interférence absorption du bruit de fond pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-peut provenir de la diffusion de la lumière par les petites particules solides et de l’absorption par les molécules qui n’ont pas été atomisées
Solution : les analyseurs doivent avoir un correcteur de fond pour corriger l’interférence
Quels sont les correcteur de fond pour corriger interférence d’AAS? Les décrire
-Lampe à émission d’un spectre continu : lampe cathode creuse = bruit de fond + absorption, lampe deutérium = bruit de fond seulement, on fait la différence des deux lampes.
-Effet Zeeman : présence d’un champ magnétique sur des atomes libres apporte à diviser les lignes d’absorption d’une part et d’autre de la ligne originelle proportionnellement à l’intensité du champ magnétique.
Quels sont les avantages de l’ICP-MS?
-grande sensibilité et linéarité
-vitesse d’analyse élevée
-quantification multiéléments et analyse des isotopes. T
-Technique qui peut faire pas mal tout avec des couts cliniques bas.
Quel est le principe de l’ICP-MS?
-pompe péristatique amène liquide au nébulisateur – production aérosol
-plus petites gouttelettes sont flitrées par chambre de nébulisation et injectées dans torche ICP-MS (seulement 10% des gouttelettes sont correctes)
-plasma sèche les aérosols, dissocie les molécules et ionise les atomes
- ions sont ensuite séparé par m/z
Quels sont les étapes retrouvées dans la torche à plasma?
-Argons entrent en collision dans deux tubes de quartz formant de ions Ar+ et une chaleur + de 6000 à 10000k.
Étapes : évaporation – vaporisation –atomisation – excitation – ionisation des composés
Quels sont les types de modes de mesures de MS?
-Scan
● Analyse d’une intervalle de masse (ex: 35 – 400)
-SIM (Selected Ion Monitoring)
● Analyse d’une seule masse qui transitionne ou d’un ensemble défini de masses
-MRM (Multiple Reaction Monitoring)
● Analyse d’une transition de masse (parent → fragment) ou d’un ensemble défini de transitions de masse
-TIC (Total Ion Chromatogram)
● Chromatogramme représentant la somme de tous les ions mesurés par la MS
(somme/ensemble de tous les ions)
● Soit d’un scan, d’une analyse SIM ou d’une analyse MRM
