Analytique Flashcards
Quel est le calcul de la loi de Beer-Lambert?
A=abc
a : coefficient d’extinction molaire
b: longueur de la trajection de la lumière
c: concentration de l’échantillon
Quelle est la relation entre l’absorbance et la transmittance?
La concentration d’une substance (proportionnelle à la quantité de lumière absorbée) = inversement proportionnelle au logarithme de la lumière transmise
A = -log Is/I0 = -logT
Est-il préférable d’avoir un coefficient d’extinction molaire bas ou élevé et pourquoi?
-Préférable d’avoir un coefficient d’absorption molaire élevé puisque plus il est grand et plus la linéarité est longue
-Ça permet de déterminer une concentration plus précise de la solution
-Ça peut permettre d’éviter de diluer les échantillons pour plus longtemps
Quel technique peut-il être utilisé en spectrophotométrie pour éviter la présence de mesures de réactions non spécifiques?
Il est possible de prendre nos données à un temps spécifique (ex: entre 10 et 20 sec) dans lequel il n’y a pas de réactions non spécifiques.
Dessine moi un spectrophotomètre à un seul rayon.
Notes de la prof:
1) source de lumière
2) façon d’isoler la λ (monochromateur)
3) fibre optique
4) cuvette (cellule d’absorption)
5) photodétecteur (convertit énergie de la lumière en énergie électrique)
6) détecteur
7) enregistreur de données
8) ordinateur
Dessine moi un spectrophotomètre à double rayons.
Spectrophotomètre double faisceau dans l’espace (double-beam-in-space)
ou
Spectrophotomètre double faisceau dans le temps (double-beam-in-time)
Nomme trois façons d’isoler un spectre.
-Filtres
-Prismes: sépare la lumière blanche en un spectre continu par réfraction
-Gratings (grillage) de diffraction: dépôt d’une mince couche d’un alliage de cuivre-aluminium sur une surface de verre plat rainurée (1000-2000 lignes/mm), principe: chacune des lignes génère un petit spectre donc celles en phase se renforcent et les autres s’annulent, donne donc un spectre continu
Illustre le principe d’un photomultiplicateur.
1) lumière arrive à photocathode (photon convertit en électron)
2) circuit de dynodes qui augmentent le nombre d’électrons, différence de potentiel croissante entre chaque dynode
3) anode : électrons détectés
*amplifie un photon en 10^7 électrons
Quels sont les inconvénients (les interférences) d’un photodétecteur?
-Lumière parasite (radiation de la longueur d’onde à l’extérieur de la bande étroite par dispersion et diffraction)
-Fluorescence potentielle de l’échantillon
Dessine moi la photométrie de réflectance et indique moi les avantages et désavantages
-Avantages-: simple, rapide, peu coûteux
-Désavantage : peu précis, l’intensité de la lumière n’est pas linéaire
Qu’est-ce que la spectrophotométrie de flamme et quels sont les avantages et désavantages? Dessine le.
-Principe: Émission de la lumière par les atomes de plusieurs éléments métalliques. Les métaux émettent dans des longueurs d’onde spécifiques lorsqu’on leur donne assez d’énergie. Les couleurs des métaux sont caractéristiques des atomes présents dans un échantillon. Technique de référence, mais peu utilisé de nos jours.
-Avantages : certains éléments sont analysés avec moins d’interférence
-désavantage : Pour l’analyse des alcalins et c’est assez coûteux
Dessine moi avec ces composants le principe d’un fluoromètre. Quels sont ses avantages et inconvénients?
-Avantages : sécuritaire (évite radio), essais homogènes, automatisée, rapide, sensible
-Désavantages : Certaines substances (drogues et ses métabolites) et autres molécules (ex : bilirubine) font de la fluorescence interférente, limité à 20kDa
Qu’est-ce que la fluorescence en temps différé? Donne moi un exemple.
-Fluorescence en temps différé : Échantillons marqués avec fluorophore avec longue demi-vie. De ce fait, la lumière mesurée est celle qui persiste lorsque les émissions non spécifiques des autres surfaces et matériaux s’éteignent. Mesure du déclin du signal de fluorescence après excitation.
-Exemple : DELFIA pour dépistage néonatale
Qu’est-ce que la fluorescence polarisée? Nomme des avantages et inconvénients.
-Fluorescence polarisée : Fluorophore absorbe plus efficacement dans les plans de ses niveaux d’énergie électronique – importance de la taille de la molécule – rotation de la molécule – on déterminer la durée moyenne de l’état d’excitation de la molécule (plus molécule grosses, et plus est élevé, + rotation est longue) – Plus rotation est longue et plus lumière reste polarisée- si lié à anticorps il y a réémission de lumière polarisé.
-Avantages : sensible, rapide, homogène, automatisée, réactifs stables
-Inconvénient : Instrumentation spécialisée, dédié au FPIA, kDa doit être plus petit que 20, pour drogues et médicaments.
Limites de la fluorescence.
-Effet de filtre intérieur (lorsque concentration de l’échantillon et fluorescence n’est plus linéaire)
-concentration quenching (plus faible fluorescence à cause d’une faible distance entre fluorophore et molécule d’intérêt)
-dispersion de lumière
-effet de la cuvette de solvant
-effet de matrice
-température (intensité de la fluorescence diminue avec l’augmentation de température)
-photodécomposition (diminution fluorescence à cause de lumières intenses)
Qu’est-ce que la chimiluminescence et donne moi un exemple.
-Chimiluminescence : Émission de lumière lorsqu’une molécule (électrons) possédant une énergie élevé (ou excité) devient basse. L’excitation est causée par une Rx chimique qui implique l’oxydation d’un composé organique (ex: luminol, isoluminol, les esters d’acridinium, la luciférine) par un oxydant (oxygène, peroxyde d’hydrogène, hypochlorite). Nécessite catalyseurs comme des enzymes (ALP) ou des ions/complexes métaliques (Cu2+, Fe2+)
-Exemple en immunologie : anticorps/haptènes liés à molécules luminescentes, lorsqu’antigène se lie à l’anticorps marqué, réaction de chimiluminescence, donc intensité lumière proportionnelle à conc échantillon (peut avoir background ou fuite de lumière)
Qu’-est ce que l’électrochimiluminescence?
Rx générée par des précurseurs stables à la surface d’une électrode (ex ruthenium tris(bipyridyl) chélaté fait une Rx oxydo-réduction avec tripropylamine)
Indiquez des facteurs qui influencent une réaction enzymatique.
-Concentration de l’enzyme (principe de base: vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration d’enzyme)
-pH (faire attention aux dilutions qui peuvent affecter la réaction vu diminution des cofacteurs)
-Température
-Molécules inhibitrices
Dans un graphique de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat, comment on calcule le Km?
Km = 1/2Vmax
Vmax se détermine avec le plateau de la courbe.
Un graphique de la vitesse de Rx en fonction de la concentration du substrat donne une courbe qui atteint un plateau. Lorsqu’on transforme cette courbe pour obtenir une droite, on fait un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]. Dans ce dernier graphique, que représentent l’abscisse et l’ordonnée à l’origine?
intersection avec axe des x (abscisse à l’origine) = -(1/Km)
intersection avec axe des y (ordonnée à l’origine) : 1/Vmax
Quel est l’effet des différents types d’inhibiteurs sur la droite dans un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]
-inhibiteur compétitif
-inhibiteur non compétitif
-inhibiteur “uncompétitif”
-inhibiteur compétitif : Km augmente et Vmax n’est pas affecté (pente plus à pic)
-inhibiteur non compétitif : Km n’est pas affecté et Vmax diminue
-inhibiteur “uncompétitif” : Km diminue et Vmax diminue
Quelle est la relation de la vitesse et de Km dans la portion linéaire d’une droite (là ou il faut prendre les mesures d’une analyse) ?
v = Km
Indiquez 2 méthodes d’analyse en enzymologie.
-Point final : Tout le substrat est transformé en produit par la réaction analytique
-Mode cinétique : Changement absorbance par unité de temps, spectro et chrono précis, cinétique initiale d’ordre 1 (vitesse proportionnelle à la concentration)
Nomme un inconvénient de la méthode point final
Inconvénient : temps réaction plus long pour une réaction complète
Indiquez des éléments à faire attention lorsqu’on fait une calibration à un facteur
-effet du pH
-température
-force ionique sur le coefficient d’absorption molaire
Indiquez 3 éléments qui font de l’interférence avec des réactions enzymatiques et quelles sont des pistes de solutions pour corriger ces interférences, lorsque possible.
Interférences:
-Turbidimétrie (lactescence/lipémie, protéines, précipité)
-Bilirubine (ictère)
-Hémolyse
Solutions:
-mesure à deux longueurs d’onde
-facteur de correction
Qu’est-ce que l’EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique)?
1-Anticorps + analyte sont mélangé et la liaison se fait
2-Ensuite, on ajoute d’un enzyme lié à l’antigène (même chose que l’analyte)
3-Les anticorps en excès vont lier l’enzyme-antigène, ce qui va diminuer l’activité de l’enzyme.
4-Mesure de l’Activité de l’enzyme (si + activité enzymatique dans échantillon donc, + analytes du patient (homogène))
Qu’est-ce que le CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay)?
1-Les Ac et le fragment donneur de l’enzyme (b-galactosidase) sont liés. L’Ac bloque la dimérisation et ainsi son activité.
2-L’ajout de l’antigène déplace le fragment donneur de l’enzyme et lie l’Ac.
3-Le fragment donneur est libéré, ce qui permet l’assemblage des deux fragments de l’enzyme et active l’enzyme.
*Si antigène présent en grande quantité, l’activité de la beta-galactosidase est maximale.
Pourquoi c’est important de calibrer une réaction enzymatique?
Pour faire la comparaison avec les pairs. Pour établir des valeurs cliniques comparables (ex: 2-3x la limite supérieure normale = problème)
Qu’est-ce qui est principalement dosé en ICP-MS?
-éléments traces (ex : cuivre, fer, fluor, manganèse, zinc) (250ug/g matrice)
-éléments ultratraces (arsenic, chrome, molybdène, nickel, sélénium, silicone, vanadium) (moins ug/g matrice)
Pourquoi regarder les éléments essentiels?
-nutrition parentérale
-absorption gastro-intestinale
-histoire d’exposition aigue ou chronique
-maladie génétique (Ex : Wilson)
-protéases orthopédiques
Dans quelles situations rechercher des métaux toxiques?
-maladie rénale idiopathique
-neuropathie périphérique bilatérale
-changement rapide de la fonction mentale
-inflammation aigue de la muqueuse nasale ou du larynx
-histoire d’exposition
Comment traiter les intoxications?
-Enlever la source décontamination du G.I. (ex :lavage)
-augmenter l’élimination (ex: chélateur acides biliaires tel que cholestyramine)
-traiter avec antidotes (ex: déféroxamine)
Qu’est-ce qui est possible de doser en complément avec les éléments?
-protéines de transport souvent aussi regard lors de dosage avec l’élément (comme transferrine pour le fer)
-regarder créatinine si urinaire.
Nomme moi deux types d’absorption atomique
-Spectrométrie d’absorption atomique à flamme -spectrométrie d’absorption atomique par four graphite
Quels sont les étapes de l’AAS général?
-échantillons en vapeur d’atomes libres
-– mesure absorption d’une lumière à longueur d’onde caractéristique à chaque élément
-– absorption proportionnelle à la concentration d’atomes libres dans le trajet du rayon lumineux.
Quels sont les composants d’un AAS à flame?
-Lampe (spécifique pour chaque élément à doser et émet spectre de ligne de l’élément à doser
-atomiseur (échantillons liquides en atome libre)
-monochromateur (isole raie de résonance)
-détecteur
-amplificateur et système d’analyse des données
Comment fonctionne le principe de l’AAS à flame?
Lampe
-nébulisateur (aspire échantillon) + brise jet/bille d’impact fractionne échantillons (élimine grosse gouttelettes (puisque serait pas capable de les rendre en atome libre vu courte exposition à la flamme) pour rester les petites gouttelettes
-Petites gouttelettes vont entrer dans la chambre ou le mélange des gaz est fait
– Brûleur (flamme) air/acétylène (2300 C) ou air/oxyde nitreux (2900C) pour doser éléments présents en concentration minimale (mélange avec échantillon)
pourquoi utiliser de l’AAS au four?
Plus sensible et complexe avec atomisation électrothermale
-Utilisé lorsque concentrationdu volume trop faible pour la technique à flamme.
Étapes de l’AAS au four?
Échantillons déposés – séchage- décomposition – atomisation – pyrolyse
Comment diminuer les interférences de matrice causé par l’AAS au four?
-Lors d’atomisation, possible d’ajouter un modificateur de matrice qui va retenir l’élément à analyser à une température plus élevée
– va uniformiser l’espèce chimique de l’élément à mesurer et facilite l’élimination des autres substances de la matrice pendant le traitement thermique de l’échantillon
Permet d’avoir des conditions facilement reproductibles de traitement chimique + atomisation et permet d’éviter des pics de d’autres éléments.
Avantages et inconvénients de l’AAS au four?
Avantages :
-Tout échantillon atomisé
-atomes + longtemps dans le trajet
-100-1000 fois plus sensible que la flamme
Désavantages :
-analyse est plus longue
-interférence chimique plus grande de la matrice
Comment aider à éviter l’effet de matrice pour l’AAS au four?
-on fait étalonnage souvent avec ajouts dosés
-Fait la courbe à partir des échantillons qui vont être analysé (spike l’échantillon pour faire la courbe)
Nomme moi les différents interférences pour l’AAS
-Interférence chimique
-Ionisation
-Interférence de la matrice
-Interférence d’émission
-Interférence spectrale
-Absorption du fond
Qu’est-ce que l’interférence chimique pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Liaison de certains métaux à d’autres espèces chimiques pour former molécules stables qui résistent à dissociation par flamme – réduit le nombre d’atomes libres dans la flamme et ainsi diminue absorbance
- Solution : augmenter température flamme ou addition élément libérateur (ex : Phosphate + calcium forme composé – ajout de bcp de lanthane éliminant interférence des phosphates sur calcium
Qu’est-ce que l’interférence d’ionisation pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Température flamme ou four fournit assez d’énergie pour enlever un électron d’un atome
– production d’un ion + qui n’a pas les mêmes lignes d’absorption que l’atome neutre
-– réduit nombre d’atomes libres neutres dans la cellules d’absorption et ainsi diminue absorbance.
-Solution : ionisation d’un élément réduit par l’ajout en grande quantité d’un autre élément plus facilement ionisable (Na ou K)
Qu’est-ce que l’interférence de matrice pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Causé par différente viscosité ou tension entre étalon et échantillons à cause des différences de concentration d’autres substances ou nature du solvant
-change vitesse d’aspiration des solutions et les caractéristiques de combustion
-Faut rendre étalon le plus similaire possible à l’échantillon
Solution :
-tout réactif ajouté dans les préparations des échantillons doit l’être dans les étalons
-une dilution importante des échantillons rend l’interférence négligeable
-si interférence persiste utiliser méthode des ajouts dosés (au moins 3 mesures par échantillon)
Qu’est-ce que l’interférence d’émission pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-Précision analytique peut être compromise dans la flamme lorsqu’un élément à concentration élevée émet fortement dans la bande spectrale passante.
-Solution :
-diminuer largeur de la fente du monochromateur
-diluer échantillon ou changer la longueur d’onde pour mesure l’AA avec perte de sensibilité
Qu’est-ce que l’interférence spectrale pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-causée par un élément de la matrice dont la longueur d’onde d’absorption tombe à l’intérieur de la largeur du raie d’absorption de l’élément dosé résultant une fausse élévation des résultats.
Solution :
-Changement de la longueur d’onde pour l’absorbance atomique mais avec baisse de sensibilité.
Qu’est-ce que l’interférence absorption du bruit de fond pour l’AAS et nomme moi des solutions pour la corriger?
-peut provenir de la diffusion de la lumière par les petites particules solides et de l’absorption par les molécules qui n’ont pas été atomisées
Solution : les analyseurs doivent avoir un correcteur de fond pour corriger l’interférence
Quels sont les correcteur de fond pour corriger interférence d’AAS? Les décrire
-Lampe à émission d’un spectre continu : lampe cathode creuse = bruit de fond + absorption, lampe deutérium = bruit de fond seulement, on fait la différence des deux lampes.
-Effet Zeeman : présence d’un champ magnétique sur des atomes libres apporte à diviser les lignes d’absorption d’une part et d’autre de la ligne originelle proportionnellement à l’intensité du champ magnétique.
Quels sont les avantages de l’ICP-MS?
-grande sensibilité et linéarité
-vitesse d’analyse élevée
-quantification multiéléments et analyse des isotopes. T
-Technique qui peut faire pas mal tout avec des couts cliniques bas.
Quel est le principe de l’ICP-MS?
-pompe péristatique amène liquide au nébulisateur – production aérosol
-plus petites gouttelettes sont flitrées par chambre de nébulisation et injectées dans torche ICP-MS (seulement 10% des gouttelettes sont correctes)
-plasma sèche les aérosols, dissocie les molécules et ionise les atomes
- ions sont ensuite séparé par m/z
Quels sont les étapes retrouvées dans la torche à plasma?
-Argons entrent en collision dans deux tubes de quartz formant de ions Ar+ et une chaleur + de 6000 à 10000k.
Étapes : évaporation – vaporisation –atomisation – excitation – ionisation des composés
Quels sont les interférences pour l’ICP-MS?
-Non spectrales
-Interférences isobariques
-Interférences Polyatomiques
-Interférences doubles charges
Comment éviter la majorité des interférences pour ICP-MS?
Ces interférences sont habituellement éliminées en utilisant un Triplequad
Qu’est-ce que les interférences non spectrales en ICP-MS et quels sont les solutions?
Effet de matrices
Solutions :
-Dilution (10X à 100X)
-standard interne
-ajouts dosés
Qu’est-ce que les interférences isobariques en ICP-MS et quels sont les solutions?
Signaux de 2 éléments différents peuvent se superposer s’ils sont présents dans le même échantillon. Ex : mesure à 114 m/z = 114Cd et 114Sn
Solution :
-Il faudrait ici utiliser une équation de correction 114Cd = mesure au m/z 114 – (0,66/24,22) x (118Sn). ) 0,66 et 24,22 viennent de l’abondance relative du 114Sn et 118Sn.
-Possible aussi de choisir un autre isotope.
Qu’est-ce que les interférences polyatomiques en ICP-MS et quels sont les solutions?
ex : analyse d’intérêt = chrome (52Cr), mais il y a interférence par 40Ar12C+
Solution :
-utiliser une cellule de collision pour fragmenter
-choisir un autre isotope.
Qu’est-ce que les interférences double charges en ICP-MS et quels sont les solutions?
ex : 138Ba2+ sur 69Ga+
Solution :
-diminué grâce à l’ajout d’une cellule de réaction (cellule de collision) ou diminuer température de la torche pour réduire quantité de molécules avec charge positive produite.
Décrit le principe général d’un HPLC en 5 étapes.
1) Un liquide circule continuellement du réservoir au détecteur
2) L’échantillon est introduit dans l’injecteur (boucle d’injection)
3) L’échantillon est injecté sur la colonne
4) Les substances interagissent avec la colonne (partition ou autre…)
5) Les substances sont détectées à la sortie de la colonne
Nomme 7 composantes d’un HPLC.
-Réservoirs et phases mobiles
-Dégazeur
-Pompes à pistons
-Injecteur automatique
-Compartiment pour colonnes
-Colonnes HPLC
-Détecteurs
Nomme deux modes de chromatographie. Comment la composition de la phase mobile varie durant la chromato dans ces deux modes?
-isocratique (composition de la phase mobile constante, phase inchangée pendant l’analyse)
-gradient (variation de la composition de la phase mobile durant la chromato)
Nomme 3 types de pompes à piston.
-pompe à 1 piston
-pompe quaternaire
-pompe binaire
Nomme 3 composantes du HPLC qui font partie intégrante du système de pompe.
-pompe
-valve anti-retour
-valve de purge (ouvrir = vidange)
-valve pour sélectionner les solvants
Quelles sont les composantes et le principe d’une pompe quaternaire?
-Composé de : 1 pompe à 2 pistons + 1 valve de sélection du solvant
-Principe : Valve de sélection de solvant s’ouvre en alternance dans les différentes lignes de solvant pour un temps proportionnel au pourcentage souhaité
ex: Pour faire une solution 70:30 des solutions A et B. La valve va être ouverte à la sol A durant 70% du temps de remplissage puis à la sol B pour les 30% restants
Quelles sont les composantes et le principe d’une pompe binaire?
-Composé de : 2 pompes à 2 pistons
-Principe : Pour faire mélange désiré, les deux pompes fournissent un débit équivalent au pourcentage de solvant souhaité
pompe A contrôle ligne de solvant A, pompe B contrôle ligne de solvant B
ex : si on veut un mélange 70 (A) :30 (B) = pompe A fonctionne à 0,7mL/min pendant que pompe B fonctionne à 0,3mL/min
Quel est l’avantage et le désavantage de la pompe binaire?
-Avantages : Mélange plus précis
-Désavantages : Plus coûteux
Qu’est-ce que le tD (délai du gradient, Gradient Dwell Time) et comment on le détermine?
Le décalage entre la composition de la phase programmée et celle ressentie à la colonne.
1) on programme un gradient linéaire avec un solvant qui absorbe en UV (ex: méthanol)
2) tD = la partie avant de commencer à avoir une augmentation linéaire de l’UV
VD = tD x débit
Quelle est la conséquence d’un mauvais raccordement des capillaires et nomme deux causes de ce problème?
Conséquence: ↑ volume extra colonne qui ↑ élargissement des pics
Causes:
-colonne trop sortie
-espace entre la férule et l’autre morceau
Quelle est la différence entre le mode filled-loop et partial-loop?
-Filled-loop : Échantillon rempli complètement la boucle donc rentre par l’entrée loin de la colonne et sort juste avant la colonne
-Partial-loop : Échantillon rempli en partie la boucle donc rentre par l’entré qui est proche de la colonne (avantage: pics plus fins et précis)
VRAI ou FAUX: Le compartiments des colonnes doit avoir une température contrôlée car ça affecte le temps de rétention (via four à effet Peltier ou four à colonne).
VRAI
Il existe plusieurs types d’interaction avec la phase stationnaire, nomme les 2 plus populaires.
intéractions hydrophobe et échange de cations
Quel es l’impact de la taille des particules en HPLC?
Plus la taille est petite et plus la chromatographie est efficace (↓ H)
- Pics plus fin (on veut des pics plus fin, petite colonne, plus difficile de passer le flo, plus de pression)
- ↑ pression
- ↑ débit
- ↓ longueur de la colonne
- ↓ temps d’analyse
Quel est l’utilité d’une pré-colonne?
-Sert à protéger la colonne (50$ pour pré-colonne vs 1000$ pour colonne)
-Retient les particules des échantillons
-Prévient la dégradation de la colonne
À quoi peut servir le ratio signal sur bruit (S/N) en HPLC et il est dans quelle formule?
-pour déterminer LOD et LOQ
limite de détection (LOD) idéal : S/N = 3
limite de quantification (LOQ) idéal : S/N = 10
- %CV ≈ 50 / (S/N)
meilleur est le signal, plus c’est reproductible
Nomme 5 modes de chromatographie.
-Adsorption (Phase normale)
-Partition (Phase inverse, Phase normale, HILIC)
-Échange d’ions
-Exclusion
-Affinité
Pour le mécanisme d’adsorption, décrit les types de chromatographie possible, la phase stationnaire, la phase mobile et le principe d’affinité de l’analyte.
Types: TLC,GC (colonne PLOT)
-Phases stationnaires solides et polaires (silice, oxyde d’aluminium, silicate de magnésium)
-Phases mobiles relativement non polaires (- polaire que phase stationnaire)
-Affinité de l’analyte pour la phase stationnaire est généralement en fonction des groupements polaires
Pour le mécanisme de partition (absorption), décrit les types de chromatographie possible, la phase stationnaire et le principe d’affinité de l’analyte.
-Types: HPLC, GC (WCOT)
-Phases stationnaires liquides (greffées sur support solide)
-Affinité de l’analyte pour la phase stationnaire est généralement en fonction de la distribution relative entre les deux liquides (généralement relié à l’hydrophobicité), les molécules rentrent dans la phase
Quelle est l’utilité de la méthode de gradient comme mécanisme de séparation?
-utilisé pour raccourcir le chromatogramme
-diminuer la diffusion longitudinale (↓ temps passé sur la colonne, pic plus fin)
-éliminer les substances qui seraient éluées tardivement
Pour le mécanisme de partition en phase normale, décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe de la méthode HILIC.
-phases stationnaires polaires (cyano, Diol, amino)
-phase mobile hydrophobe sans eau (hexane, dichlorométhane et tétrahydrofurane)
-HILIC (Hydrophilic interaction chromatography):
–Chromatographie en phase normale (silice) avec phase mobile aqueuse-organique (polaire)
–Rétention : Plus %B est élevé et plus les composés sont retenus sur la colonne (interactions hydrophiles avec une couche d’eau qui se forme sur la phase stationnaire)
Pour la chromatographie d’affinité, décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe d’affinité.
-Phase stationnaire recouverte d’un ligand spécifique: enzymes/substrat, antigène/anticorps, biotine/avidine, hormone/récepteur, lectines/sucres
-Phases mobile aqueuse compatible avec les analytes à séparer
-Principe : reconnaissance spécifique du ligand immobilisé et élution par ajout de ligand libre dans la phase mobile (gradient)
Pour la chromatographie par échange d’ions, décrit la phase stationnaire et la phase mobile.
Phases stationnaires chargées dans lequel il va y avoir compétition pour les sites de liaison entre les analytes chargés et les contre-ions de la phase mobile (analyte compétitionne avec le contre ion pour lier la phase)
-Échanges d’anions :
–WAX (weak anion exchanger, -NH3+
–SAX (strong cation exchanger, -N(CH3)3+
–strong: reste ionisé dans une plage plus grande de pH que weak
-Échanges de cations (entre le contre ion et analyte) :
–WCX (weak cation exchanger –COO-)
–SCX (strong cation exchanger, -SO3-)
Phase mobile aqueuse
tamponné pour contrôler le pH
contient un contre-ion (Na+, K+,cl-,etc..) sous forme de sel
Quelles sont les application cliniques de la chromatographie par échange d’ions?
pour regarder:
-acides aminés
-peptides
-protéines
-nucléotides et oligonucléotides
-Peut aussi aider la purification d’eau (déionisation)
Pour la chromatographie d’exclusion, décrit la phase stationnaire, la phase mobile, le principe de rétention et l’utilité.
-Phases stationnaire poreuses (dextran, agarose, polyacrylamide, polystyrène-divinylbenzène)
-Phase mobile aqueuse (compatible avec les analytes à séparer)
-Principe de rétention: Rétention seulement fonction de la capacité des molécules à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire (taille de la molécule (grosse molécules sont éluées rapidement), Forme de la molécule, Hydratation)
ex: petite molécule se perdre dans les trous, pas les grosses
-Utilité : Chromatographie préparation pour purification de protéines ou pour déterminer poids moléculaire de protéines (structure quaternaire, multimères)
Pour la chromatographie de partition en phase inverse (RPC), décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe de rétention.
-Phase stationnaire non polaire (rétention basé sur l’affinité hydrophobique des molécules)
–C8, C18
–end-capped C18 (C18 avec autre réactif pour bloquer silanols libres)
–phényl
–PFP: Pentafluorophenyl
-Phase mobile hydrophile (p/r à phase stationnaire)
–eau + solvant organique polaire (méthanol, acétonitrile)
–par définition : A = phase aqueuse et B = phase organique
-Principe de rétention en RPC : rétention en fonction de l’hydrophobicité avec une ordre élution du plus polaire au moins polaire
Comment bien choisir un tampon en RPC?
-On choisit donc le tampon en fonction du pH qu’on veut pour la phase mobile :
–pouvoir tampon est maximum au pKa (±1 unité)
–50% ionisation = pKa
–20% ionisation ≈ pKa - 1
–80% ionisation ≈ pKa + 1
-Acide phosphorique, diphosphate et monophosphate (pas volatile) sont les plus utilisés en HPLC sans MS (car solubilité limité et précipite) pendant qu’acide formique/acétique + utilisé en MS (volatile)
La capacité du tampon est meilleure quand?
-pH phase proche du pKa tampon (<1 unité)
-pH phase différent du pKa de l’analyte (> 1-2 unités)
-concentration du tampon + grande
-volume d’injection petit
Après préparation, l’échantillon doit être dans un solvant qui permet la rétention de l’analyte, quels sont les paramètres de ce solvant?
-Faible concentration de solvant organique en RPC
-faible concentration de sels en échange d’ions
-pH similaire à la phase mobile (possible de pré-acidifier l’échantillon)
Nomme les 6 étapes d’une méthode HPLC-UV typique (Acide mycophénolique).
- Pré-traitement de l’échantillons sérique avec 1-ajout de standard interne, 2-précipitation des protéines avec méthanol et 3-centrifugation
- Transfert du surnageant dans un vial HPLC et mise sur l’injecteur automatique
- Conditionnement de la colonne (méthanol 100% pour 15mins) (tjrs faire pour reverse phase)
- Équilibration de la colonne avec la phase mobile pour 10 mins (30% phosphate et 70%méthanol)
- Injection des spécimens
- Vérification/impression des chromatogrammes
Nomme les avantages (2) et inconvénients (2) de la chromatographie.
Avantages
-plusieurs analyses sur le même échantillon
-aucun réactif dispendieux
-adaptable rapidement à un nouveau dosage
Désavantages
-Procédé long (prétraitement et temps chromatographique)
-appareillage complexe et coûteux
-entraînement spécial des technologiste
Quel est le principe général d’un spectromètre de masse?
- L’échantillon est introduit dans le MS par l’interface
● Échantillon liquide ou gazeux - Les substances sont ionisées dans la source
● Sous vide ou à pression atmosphérique - Les ions produits sont séparés selon leur ratio masse sur charge (m/z)
- Les ions sont détectés et quantifiés
- Les données sont analysées par ordinateur
Est-ce que le vide est important pour un MS?
oui
L’intérieur du spectromètre de masse doit être sous vide pour permettre aux ions de se rendre au détecteur sans collision avec des gaz
Est-ce que seulement les ions peuvent être séparés par spectrométrie de masse?
Oui
Qu’est-ce qu’un spectre de masse?
-Spectre de masse
● graphique de l’intensité en fonction du ratio masse/charge
● Représente « l’empreinte » de la molécule (Ion moléculaire + fragments)
○ ion moléculaire = le plus lourd dans notre spectre de masse (molécule
d’intérêt)
○ les autres c’est des fragments (perte de proton)
Qu’est-ce que le pic de base, le pic moléculaire et le patron isotopique?
-Pic de base (« base peak »)
● Pic le plus intense dans le spectre de masse ⇒ toujours normalisé à 100%
● Par convention, l’intensité des autres pics et normalisée par rapport à ce pic
-Pic moléculaire
● Pic correspondant à l’ion moléculaire (M+)
● parfois pic moléculaire = pic de base, mais pas toujours le cas
Patron isotopique
-caractéristique de la distribution naturelle des isotopes
-Exemple Chlore
● 35Cl = 100%
● 37Cl = 32% (de la hauteur du pic le + intense)
Quel type d’ionisation allons-nous utiliser pour GC et HPLC?
-En GC, l’échantillon est déjà volatilisé (dans l’injecteur du GC)
● Modes d’ionisation:
○ Impact électronique (EI – Electron Impact)
○ Ionisation chimique (CI – Chemical
Ionisation)
-En HPLC, l’échantillon doit être volatilisé avant de pénétrer dans
le MS
● Mode d’ionisation:
○ ESI (Electrospray)
○ APCI (Atmospheric Pressure Chemical
Ionisation)
○ APPI (Atmospheric Pressure
Photo-Ionisation)
MALDI
Mettre en ordre croissant la force de fragmentation des différentes méthodes ionisations.
○ 1.MALDI (moins forte en terme de
fragmentation, + de molécule non fragmentée)
○ 2.ESI
○ 3.APCI/APPI
○ 4.CI (surtout GC-MS)
○ 5.EI (presque tout est fragmenté)
Comment fonctionne le principe de l’impact électronique?
● Les substances passent dans un faisceau dense d’électrons à haute énergie (standardisée à
70 eV)
● Il y a perte d’un électron et augmentation de l’énergie interne (énergie excédentaire)
● L’énergie excédentaire est distribuée de façon uniforme dans la molécule (en énergie
vibrationnelle)
● Certains liens vont se dissocier si l’énergie excédentaire est suffisante (les liens les plus faibles brisent en premier)
Est-ce que l’impact électronique ionise en mode négatif?
Non
Nomme un avantage et inconvénient de l’impact électronique
Désavantages :
-Réarrangements moléculaires possibles (inconvénient: les fragments peuvent se combiner)
Avantages : Patrons de fragmentation très reproductibles (seulement en GC-MS)
Principe de l’ionisation chimique?
-Production d’ions par collision avec des molécules de gaz réactif/gaz ionisé
● La source contient un gaz (pression 0,1 – 1 Torr, petite quantité de gaz)
● Le gaz est « activé » par un faisceau d’électrons énergétiques
● Les analytes entrent en collision avec le gaz réactif et il y a transfert de protons ou
d’électrons
● formation de molécule MH+
Qu’est-ce qui affecte la réaction d’ionisation en ionisation chimique?
● Nature du gaz réactif (méthane, isobutane…)
● La pression du gaz dans la source
Qu’est-ce qu’on utilise pour avoir des fragments ou des molécules ionisés ?Impact électronique vs ionisation chimique
● impact électronique pour avoir fragment (+ rough)
● faire ionisation chimique pour avoir molécule (-rough)
Quel est le mécanisme de l’électrospray?
● *nébulisateur placé de façon orthogonal à l’entrée dans MS (pour éviter entrée des goutte non évaporée)
● La phase mobile contenant les analytes passe dans une aiguille à laquelle un fort potentiel est appliqué (4-5 kV)
● Du gaz est aussi appliqué de façon axiale pour aider à la nébulisation (tailor cone)
● De fines gouttelettes sont formées et possèdent une charge à leur surface
● Les gouttelettes s’évaporent progressivement dans la source chauffée
● Lorsque la répulsion des charges excède la force de tension de surface, les gouttelettes éclatent et les charges sont distribuées aux analytes en fonction de leur affinité protonique
Ionisation positive ou négative en ESI?
Les deux
Dans quelle situation c’est utile d’avoir des ions avec multiple charge par ESI?
-Idéal pour les haut poids moléculaires (multiples charges): protéines et peptides
-ex: spectre de la myoglobine (gros pic à 16 000, mais décorticé entre à plus petit m/z,
même patron mais juste z qui change, possible de faire une dé-convolution et
reconstruction le spectre réel
Pour quelle type de molécules la méthode ESI est faite?
Surtout pour les analytes capables de former des ions en solution donc, molécules polaires ou chargées.
Nomme une interférence très importante en ESI et décrit cette interférence
-Suppression d’ions
-compétition pour la charge (ex: sang, avec phospholipide)
-Réduction de l’efficacité d’ionisation d’un analyte d’intérêt.
● Perte de signal au détecteur
● Précision et exactitude peuvent être compromises (et quantification reproductible)
-Sources ESI plus affectées que APCI
● Suppression en phase liquide vs phase gazeuse
● + sujet pour les électrospray car échantillon liquide
Quel est le principe de l’APCI? Est-ce que cela peut former des ions multiplement chargés?
-Très similaire à ESI, sauf que l’ionisation est effectuée par une autre aiguille (« Corona Discharge »)
● on ne met pas la charge sur l’aiguille
● l’ionisation n’est pas fait sur la molécule directement mais sur le gaz en premier et ensuite transféré sur la molécule d’intérêt
-il s’agit d’une ionisation chimique
-Ne forme pas d’ions multiplement chargés
Qu’est-ce que l’APPI?
Atmospheric Pressure Photo-Ionisation)
-Comme APCI, mais utilise un faisceau de photons pour ioniser les analytes (directement ou avec dopants)
Quels types de molécules pour APPI, APCI et ESI?
-Electrospray: bon pour molécule polaire ou très polaire,
avantage :molécule haut poids moléculaire
-les 2 autres c’est juste du simple charge donc molécule + petites, polaire ou non
Quel est le mécanisme du MALDI et il est idéal pour l’utilisation de quel MS?
-Mécanisme:
● Les analytes sont mélangés à une matrice qui est placé sur un plaque pour introduire dans la source
● Un laser pulsé émet une lumière intense que la matrice absorbe
● La matrice se désorbe de la plaque et entraîne les analytes
● Les analytes sont ionisés
-Produit des pulsations d’ions : Idéal pour analyse par TOF (time of light) car fonctionne aussi par pulsation
● TOF pas le best pour LC car liquide arrive toujour en continu
Qu’est-ce qui cause la suppression d’ions et qu’est-ce qui peut causer la suppression d’ions?
-La suppression ionique est engendrée par une élution simultanée de l’analyte d’intérêt avec des molécules contaminantes.
-ce qui peut causer suppression d’ions:
● Sels non volatils
● Agents de pairage ionique (agent pour rendre molécule + soluble)
● Métabolites endogènes (ex: phospholipide sanguin)
● Médicaments
● Composantes de la matrice biologique
Quels sont les mécanismes de la suppression d’ions?
- Précipitation ou co-précipitation (sels peuvent se former et précipiter, le gros se passe ici surtout en ESI)
- Évaporation incomplète (entraîne signal incomplet)
- Éjection de la gouttelette sous forme neutre (molécule ne capte pas la charge)
- Neutralisation ou transfert de charge en phase gazeuse (molécule capte charge en gouttelette, s’évapore et se fait voler son proton par autre molécule)
Comment mettre en évidence la suppression d’ions?
-Ajouts dosés (spiker l’analyte dans des extraits de matrice)
● Façon de faire:
○ 1-prendre matrice (ex: sang total)
○ 2-extraire matrice
○ 3-faire même chose avec eau avec eau
○ 4-spiker la même quantité d’analyte dans ces 2matrices et comparer
● Comparaison des réponses MS pour les analytes ajoutés dans des extraits de matrice ou des extraits d’eau
● Mesure de l’ampleur de la suppression
● ex: suppression d’environ 50% dans le sang total p/r à eau
-Infusion post-colonne (infuser l’analyte de façon constante après la chromato)
● Façon de faire:
○ 1. Infusion constante de l’analyte d’intérêt
○ 2. Injection d’un extrait d’échantillon ne
contenant pas l’analyte
● Localisation temporelle de la suppression d’ions
● ex: on voit qu’il y a une suppression d’ion au debut
Comment diminuer des effets de suppression?
-Pré-traiter les échantillons pour obtenir des extraits plus propres
● Extraction liquide-liquide ou extraction en phase solide (+ propre)
● ↑ Complexité et ↑ Coût (matériel / technique)
-Optimiser la chromatographie pour séparer l’analyte des régions de suppression ionique
● faire sortir l’analyte dans une autre région où il n’y a pas de suppression ionique
● ↑ Temps d’analyse
-Compenser la suppression ionique en utilisant l’analyte deutéré comme standard interne
● Disponibilité limitée et coût élevé
● avantage: meilleure précision pour standard deutéré
-Note: possible de conditionner dans sang total
● s’assurer que notre suppression ionique est constante et reproductible selon la matrice sanguine (ex: sérum)
● ex: matrice urinaire = très variable en composantes donc peut amener plus de
suppression ionique variable (pas possible de compenser en calibrant dans urique, trop variable)
● on pourrait prendre le standard interne deutéré dans ce cas-là
Nomme 4 types de spectromètre de masse pour mesure des masses
● Quadripôles
● Trappes ioniques
● Temps d’envol
● Secteurs électromagnétiques
Comment faire pour avoir 2 mesures de masse pour la même molécule?
spectrométrie de masse en tandem
Permet d’avoir :
-Ions parents
-Ions produits (fragments)
Qu’est-ce qu’un quadrupôle? Quel est le principe?
- « filtres de masse » qui laissent passer de façon séquentielle uniquement les ions avec un m/z choisi
-Sélection des masses basée sur la stabilisation de la trajectoire des ions entres les 4 pôles
-Principe:
● ions pénètre dans les 4 pôles et sa trajectoire = affectée par charge et masse
● résonant : capable de passer
● non résonnant: se ramasse dans le vide
Quels sont les types de modes de mesures de MS?
-Scan
● Analyse d’une intervalle de masse (ex: 35 – 400)
-SIM (Selected Ion Monitoring)
● Analyse d’une seule masse qui transitionne ou d’un ensemble défini de masses
-MRM (Multiple Reaction Monitoring)
● Analyse d’une transition de masse (parent → fragment) ou d’un ensemble défini de transitions de masse
-TIC (Total Ion Chromatogram)
● Chromatogramme représentant la somme de tous les ions mesurés par la MS
(somme/ensemble de tous les ions)
● Soit d’un scan, d’une analyse SIM ou d’une analyse MRM
Comment analyser des fragments avec un quadripole?
-Analyse de fragments avec un quadripôle
● La source d’ionisation est à pression atmosphérique
● Après la source, il y a un région à pression réduite (ex: 2 Torr) que les ions
doivent franchir avant d’accéder au quadripôle
● Les ions sont entraînés par une différence de potentiel
● Si on augmente suffisamment ce voltage, l’ion moléculaire est fragmenté
○ on applique une différence de potentiel pour que le flot des ions se fasse, on tire les ions + qui traverse le gaz rideau (gaz axial)
○ si on tire trop, ça fait des fragment, donc aussi façon de faire des fragments
-augmentation de la différence de potentiel qui cause des fragmentation
● en haut (+ grand voltage): seulement des
fragments de fragments
● milieu: on commence à voir des fragments
● en bas (+ faible voltage): seulement ion
moléculaire
avantages du QQQ? Quel est son set up?
Avantages :
● Meilleure spécificité (meilleur ratio signal/bruit)
● Meilleure sensibilité
Set-up:
● source d’ions
● Q#1 permet de mesurer molécule non fragmenté
● Q#2 sert de cellules de collisions pour briser les molécules en fragments
● Q#3 mesure la masse des fragments produits
● détecteur
Comment fonctionne la cellule de collision?
-Cellule contient un peu de gaz
-Une différence de potentiel est appliquée entre l’entrée et la sortie de la cellule (briser lien les + faibles en premier)
Comment est-ce qu’on contrôle la fragmentation?
-On contrôle la fragmentation en optimisant le voltage appliqué sur la cellule (« Collision
Energy »)
● + le voltage est élevé, + la collision est violente, + on fragmente
Qu’est-ce que fait une trappe ionique?
-permettent d’accumuler spécifiquement des ions d’intérêt
-Les ions peuvent être quantifiés ou caractérisés par fragmentation
-permet de faire des fragmentations successive (MSn)
● toujours refragmenter les fragments et ainsi de suite
○ 1.accumulation
○ 2.éjection des ions non voulus
○ 3.collision
○ 4.éjection et détection des ions d’intérêt
● En autant que l’abondance des fragments le permette
Qu’est-ce qu’une trappe ionique linéaire?
-Trappes ioniques linéaires (Q-Trap)
● Q3 est remplacé par une trappe ionique linéaire (Quadripôle modifié)
● Meilleure sensibilité due à l’accumulation des ions avant la détection
Qu’est-ce que permet le TOF?
-Mesure des masses basée sur le temps requis pour qu’un ion parcourt une distance
connue
● ex: gros = moins vite et arrive en dernier
● ex: charge = moteur et masse = ce qui le ralentit
-On doit permettre à tous les ions d’arriver au détecteur avant d’introduire d’autres ions
dans l’appareil
● Analyse pulsée (MALDI-TOF)
Q-TOF
● Le « pusher » est activé de façon pulsée
● utile pour la protéomique
● Quad (sélectionne les ions) suivi de cellule de collision:
Expliquer le détecteur du MS?
-La détection des ions en MS est presque toujours accomplie à l’aide de multiplicateurs d’électrons
-Différence de potentiel entre chaque dynodes et mesure le courant à la fin sur anode
Quels sont les 3 types de calibration pour les analyses chromatographiques? Expliquer
1.Étalonnage par ajouts dosés
● Peu fréquent
● Pour analyses avec effet de matrice prononcé
● Requiert plusieurs analyses par échantillon !
● on a un échantillon inconnu, on dose,
on reprend le même échantillon et on
spike 2-3x notre analyte d’intérêt,
faire une droite, on retrouve la concentration de notre inconnu avec
l’interception avec les X
● pas meilleure méthode car variable
2.Étalonnage externe
● Peu fréquent
● Méthode de calibration généralement employée pour les autres types d’analyses (colorimétrique, immunologiques…)
● mesurer concentrations connues, tirées une droite, et s’en servir pour identifier concentration
3.Étalonnage interne
● Méthode la plus fréquente
● Utilisation d’un standard interne
(concentration fixe dans tous les
échantillons)
● Courbe du ratio analyte/standard interne en fonction de la concentration d’analyte
● on mesure les ratio
Quels sont les caractéristiques du standard interne?
● Caractéristiques du standard interne:
○ Chimiquement comparable à l’analyte
○ Pas présent dans l’échantillon à analyser
○ Séparé des analytes
■ Par le tR en HPLC-UV
■ Par le tR ou la masse en MS
○ Réagis de la même façon que les analytes aux variations analytiques
Le standard interne corrige pour quoi?
○ Rendement d’extraction
○ Suppression d’ions en MS (parfois)
○ Erreurs de pipetage (dans les étapes suivant l’addition du standard
interne), ex: volume de solvant organique pour précipiter les protéines
○ Variations du volume d’injection
○ Variations légères dans les conditions chromatographiques
○ Sensibilité de détecteur (MS particulièrement); la réponse a tendance a
diminué dans le temps, tout au long des analyse des 150 patients
Comment quantifier les masses en LC-MS?
-quantifie les masses (ou les transitions) de façon séquentielle
● « Dwell time » = temps passé à quantifier chaque masse
● Le ratio signal/bruit augmente lorsque le dwell time est augmenté (meilleur)
-Par contre, on doit avoir suffisamment de points dans le pic chromatographique pour permettre une bonne intégration
● Minimum 10-12 points pour avoir une bonne intégration
-Le dwell time est ajusté en fonction du nombre de transitions à mesurer et de la largeur des pics chromatographiques
● ex: largeur = 1 min, avoir 12 point en 1min = ok
● ex2: si largeur en UPLC = 3 sec, plus difficile d’avoir 12 points entre ça
● ajuster le dwell time en fonction de ça mais min 30msec entre chaque
10
Étapes de mise au point d’une nouvelle méthode par LC-ESI-QQQ
-Comme toute analyse de laboratoire, le développement d’une nouvelle méthode par spectrométrie de masse débute par une évaluation des besoins cliniques et de l’utilité de l’analyse
-La littérature déjà publiée sur les méthodes HPLC ou LC-MS pour le paramètre d’intérêt doit aussi être revue
- Trouver le matériel
● Après revue de littérature, on se fait une idée sur:
○ La méthode de préparation de l’échantillon à employer
○ Le type de colonne chromatographique à utiliser
○ La limite de quantification à viser
● Aussi, on achète étalon de pureté suffisante (idéalement certifiée, poudre ou solution) - Trouver les paramètres MS
● Remplacer la colonne chromatographique du HPLC-MS/MS par un union (+ rapide)
○ Flow Injection Analysis (FIA)
● Diluer l’étalon à une concentration suffisante dans une solution compatible avec la préparation d’échantillon envisagée
○ ex: 1 g/mL dans méthanol 50%
● Préparer une phase mobile similaire
○ ex: Méthanol 50% +0,1% acide formique - Établir paramètre de la source ESI
● Paramètre généraux:
○ Température: 350 C
○ Débit du gaz: 10 – 12 L/min
○ Pression du gaz: 40 – 60 psi
○ Voltage de l’aiguille: 4 000 V
○ Débit LC: 0,5 mL/min
● Selon littérature - Trouver la masse de l’analyte
● Faire une injection en mode SCAN
○ Choisir un intervalle compatible avec la masse du produit, mais plus large (ex:
400 – 1 100 Da pour une molécule de 1 000 Da)
○ Ionisation en mode positif (M+1) ou négatif (M-1), selon littérature ou
structure chimique - Optimiser le voltage du fragmenteur
● Faire une injection en mode SIM et varier le voltage du fragmenteur
● masse identifiée dans le SCAN (laisser passer juste ca, ex: 980,6)
● but: avoir transmission maximal sans fragmentation, on voit que ca diminue a 375V - Identifier les fragments
● Faire une injection en mode PRODUCT ION
○ Masse du précurseur fixée (ex: 980,6)
○ Voltage du fragmenteur connu (ex: 325 V)
○ Énergie de collision minimale (ex: 5-10 V)
● ex: beau fragment à 389 pour le quant, lui à côté a 400ish pourrait être le qualifier - Optimiser l’énergie de collision
● Faire une injection en mode MRM et varier l’énergie de collision (et fixer Q3)
○ Masse du précurseur fixe (ex: 980,6)
○ Voltage du fragmenteur connu (ex: 325 V)
○ Masses des fragments connues (ex: 389,4 et 409,3)
● ex: trop d’E (70): fragment fragmente à leur tour aussi - Optimiser la chromatographie
● Commencer par gradient
○ ex: 5 à 100% méthanol sur 10 min)
● Optimiser chromatographie (surtout k)
● Lorsque rétention est satisfaisante, refaire optimisation pour le voltage du fragmenteur et l’énergie de collision
○ Paramètres peuvent variés en fonction de la composition de la phase mobile
● Vérifier effet d’une modification des paramètre de la source (T°, pression, voltage aiguille)
○ On cherche le meilleur rapport signal au bruit - Valider la méthode
● Comme les autres méthodes, plus:
○ SUPRESSION D’IONS
○ Rendement d’extra
