Analytique Flashcards
Quel est le calcul de la loi de Beer-Lambert?
A=abc
a : coefficient d’extinction molaire
b: longueur de la trajection de la lumière
c: concentration de l’échantillon
Quelle est la relation entre l’absorbance et la transmittance?
La concentration d’une substance (proportionnelle à la quantité de lumière absorbée) = inversement proportionnelle au logarithme de la lumière transmise
A = -log Is/I0 = -logT
Est-il préférable d’avoir un coefficient d’extinction molaire bas ou élevé et pourquoi?
-Préférable d’avoir un coefficient d’absorption molaire élevé puisque plus il est grand et plus la linéarité est longue
-Ça permet de déterminer une concentration plus précise de la solution
-Ça peut permettre d’éviter de diluer les échantillons pour plus longtemps
Quel technique peut-il être utilisé en spectrophotométrie pour éviter la présence de mesures de réactions non spécifiques?
Il est possible de prendre nos données à un temps spécifique (ex: entre 10 et 20 sec) dans lequel il n’y a pas de réactions non spécifiques.
Dessine moi un spectrophotomètre à un seul rayon.
Notes de la prof:
1) source de lumière
2) façon d’isoler la λ (monochromateur)
3) fibre optique
4) cuvette (cellule d’absorption)
5) photodétecteur (convertit énergie de la lumière en énergie électrique)
6) détecteur
7) enregistreur de données
8) ordinateur
Dessine moi un spectrophotomètre à double rayons.
Spectrophotomètre double faisceau dans l’espace (double-beam-in-space)
ou
Spectrophotomètre double faisceau dans le temps (double-beam-in-time)
Nomme trois façons d’isoler un spectre.
-Filtres
-Prismes: sépare la lumière blanche en un spectre continu par réfraction
-Gratings (grillage) de diffraction: dépôt d’une mince couche d’un alliage de cuivre-aluminium sur une surface de verre plat rainurée (1000-2000 lignes/mm), principe: chacune des lignes génère un petit spectre donc celles en phase se renforcent et les autres s’annulent, donne donc un spectre continu
Illustre le principe d’un photomultiplicateur.
1) lumière arrive à photocathode (photon convertit en électron)
2) circuit de dynodes qui augmentent le nombre d’électrons, différence de potentiel croissante entre chaque dynode
3) anode : électrons détectés
*amplifie un photon en 10^7 électrons
Quels sont les inconvénients (les interférences) d’un photodétecteur?
-Lumière parasite (radiation de la longueur d’onde à l’extérieur de la bande étroite par dispersion et diffraction)
-Fluorescence potentielle de l’échantillon
Dessine moi la photométrie de réflectance et indique moi les avantages et désavantages
-Avantages-: simple, rapide, peu coûteux
-Désavantage : peu précis, l’intensité de la lumière n’est pas linéaire
Qu’est-ce que la spectrophotométrie de flamme et quels sont les avantages et désavantages? Dessine le.
-Principe: Émission de la lumière par les atomes de plusieurs éléments métalliques. Les métaux émettent dans des longueurs d’onde spécifiques lorsqu’on leur donne assez d’énergie. Les couleurs des métaux sont caractéristiques des atomes présents dans un échantillon. Technique de référence, mais peu utilisé de nos jours.
-Avantages : certains éléments sont analysés avec moins d’interférence
-désavantage : Pour l’analyse des alcalins et c’est assez coûteux
Dessine moi avec ces composants le principe d’un fluoromètre. Quels sont ses avantages et inconvénients?
-Avantages : sécuritaire (évite radio), essais homogènes, automatisée, rapide, sensible
-Désavantages : Certaines substances (drogues et ses métabolites) et autres molécules (ex : bilirubine) font de la fluorescence interférente, limité à 20kDa
Qu’est-ce que la fluorescence en temps différé? Donne moi un exemple.
-Fluorescence en temps différé : Échantillons marqués avec fluorophore avec longue demi-vie. De ce fait, la lumière mesurée est celle qui persiste lorsque les émissions non spécifiques des autres surfaces et matériaux s’éteignent. Mesure du déclin du signal de fluorescence après excitation.
-Exemple : DELFIA pour dépistage néonatale
Qu’est-ce que la fluorescence polarisée? Nomme des avantages et inconvénients.
-Fluorescence polarisée : Fluorophore absorbe plus efficacement dans les plans de ses niveaux d’énergie électronique – importance de la taille de la molécule – rotation de la molécule – on déterminer la durée moyenne de l’état d’excitation de la molécule (plus molécule grosses, et plus est élevé, + rotation est longue) – Plus rotation est longue et plus lumière reste polarisée- si lié à anticorps il y a réémission de lumière polarisé.
-Avantages : sensible, rapide, homogène, automatisée, réactifs stables
-Inconvénient : Instrumentation spécialisée, dédié au FPIA, kDa doit être plus petit que 20, pour drogues et médicaments.
Limites de la fluorescence.
-Effet de filtre intérieur (lorsque concentration de l’échantillon et fluorescence n’est plus linéaire)
-concentration quenching (plus faible fluorescence à cause d’une faible distance entre fluorophore et molécule d’intérêt)
-dispersion de lumière
-effet de la cuvette de solvant
-effet de matrice
-température (intensité de la fluorescence diminue avec l’augmentation de température)
-photodécomposition (diminution fluorescence à cause de lumières intenses)
Qu’est-ce que la chimiluminescence et donne moi un exemple.
-Chimiluminescence : Émission de lumière lorsqu’une molécule (électrons) possédant une énergie élevé (ou excité) devient basse. L’excitation est causée par une Rx chimique qui implique l’oxydation d’un composé organique (ex: luminol, isoluminol, les esters d’acridinium, la luciférine) par un oxydant (oxygène, peroxyde d’hydrogène, hypochlorite). Nécessite catalyseurs comme des enzymes (ALP) ou des ions/complexes métaliques (Cu2+, Fe2+)
-Exemple en immunologie : anticorps/haptènes liés à molécules luminescentes, lorsqu’antigène se lie à l’anticorps marqué, réaction de chimiluminescence, donc intensité lumière proportionnelle à conc échantillon (peut avoir background ou fuite de lumière)
Qu’-est ce que l’électrochimiluminescence?
Rx générée par des précurseurs stables à la surface d’une électrode (ex ruthenium tris(bipyridyl) chélaté fait une Rx oxydo-réduction avec tripropylamine)
Indiquez des facteurs qui influencent une réaction enzymatique.
-Concentration de l’enzyme (principe de base: vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration d’enzyme)
-pH (faire attention aux dilutions qui peuvent affecter la réaction vu diminution des cofacteurs)
-Température
-Molécules inhibitrices
Dans un graphique de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat, comment on calcule le Km?
Km = 1/2Vmax
Vmax se détermine avec le plateau de la courbe.
Un graphique de la vitesse de Rx en fonction de la concentration du substrat donne une courbe qui atteint un plateau. Lorsqu’on transforme cette courbe pour obtenir une droite, on fait un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]. Dans ce dernier graphique, que représentent l’abscisse et l’ordonnée à l’origine?
intersection avec axe des x (abscisse à l’origine) = -(1/Km)
intersection avec axe des y (ordonnée à l’origine) : 1/Vmax
Quel est l’effet des différents types d’inhibiteurs sur la droite dans un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]
-inhibiteur compétitif
-inhibiteur non compétitif
-inhibiteur “uncompétitif”
-inhibiteur compétitif : Km augmente et Vmax n’est pas affecté (pente plus à pic)
-inhibiteur non compétitif : Km n’est pas affecté et Vmax diminue
-inhibiteur “uncompétitif” : Km diminue et Vmax diminue
Quelle est la relation de la vitesse et de Km dans la portion linéaire d’une droite (là ou il faut prendre les mesures d’une analyse) ?
v = Km
Indiquez 2 méthodes d’analyse en enzymologie.
-Point final : Tout le substrat est transformé en produit par la réaction analytique
-Mode cinétique : Changement absorbance par unité de temps, spectro et chrono précis, cinétique initiale d’ordre 1 (vitesse proportionnelle à la concentration)
Nomme un inconvénient de la méthode point final
Inconvénient : temps réaction plus long pour une réaction complète