analisis de acidos nucleicos Flashcards
primer paso para los estudios de biologia molecular y para las tecnicas de DNA recombinante, secuenciacion, mutagenesis
extraccion de DNA
la eleccion del metodo para extraccion del DNA va a depende de:
- tipo de ac nucleico que se va a extraer
- organismo origen del acido nucleico
- fuente del acido nucleico
- tecnica en que se utalizara el acido nucleico extraido
la extraccion del ADN se aplica en ciencias como:
medicina forense, bioinformatica, nanotecnologia de DNA e historia y antropologia
pasos para sacar el DNA
- lisis de la celula
- separacion
- purificacion
- precipitacion
- lavado
- disolucion
pasos para extraccion de DNA por la tecnica fenol-cloroformo
- lisis de las celulas y liberacion de DNA
- extraccion de proteinas y lipidos con solventes organicos
- precipitacion de DNA
- lavado de DNA
el metodo de columnas es parecido al metodo de:
metodo de perlas
en qué consiste el metodo de columnas?
- rompen la celula
- ponen un filtro que atrae al DNA y quita las proteinas
- se quita el filtro
para llevar a cabo la cuantificacion del DNA se utilizan las tecnicas:
- espectrofotometria
- fluorometria
en qué consiste la tecnica de espectrofotometria?
pasa un haz de luz a traves del DNA y mientras mas luz absorba, mayor concentracion de DNA hay
metodo mas comun para la cuantificacion de DNA
espectrofotometria
en que consiste la tecnica de fluorometria?
union de colorantes fluorescentes al acido nucleico, absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior
la PCR fue creada por _ en _
Mullis en 1986
para realizar una PCR se necesitan:
- secuencia de DNA
- enzima DNA pol
- desoxirribonucleotidos
- primers
- cofactores para la enzima
DNA pol comercial usada en PCR
Taq polimerasa obtenida de una bacteria
desoxirribonucleotidos utilizados en PCR
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
pH adecuado para la ADN polimerasa
8.4
cofactor de la Taq polimerasa
cloruro de magnesio
caracteristicas de los iniciadores de la PCR
- se diseñan para cada gen
- ricos en G y C
- proporcionan un extremo 3’ para la pol
- pueden ser forward (5’-3’) o reverse (3’-5’)
fases de la PCR
- desnaturalizacion
- hibridacion
- extension
qué sucede en la fase de desnaturalizacion de la PCR?
se separan las cadenas de DNA
qué sucede en la fase de hibridacion de la PCR?
se alinean los primers al extremo 3’
qué sucede en la fase de extension de la PCR?
la Taq pol actua sobre el complejo templado de primers y agrega dNTPs complementarios para crear cadenas completas
temperatura de cada fase de la PCR
- desnaturalizacion: 95º
- hibridacion: 50-60º (Tm)
- extension: 72º
tipos de PCR
- PCR estandar o punto final
- PCR multiplex
- PCR-RFLP
- RT-PCR (transcriptasa reversa)
- qPCR o tiempo real
PCR mas comun
PCR estandar o punto final
PCR utilizada para COVID
RT-qPCR o RT-PCR tiempo real
siempre que hacemos un PCR punto final hacemos una _ despues
electroforesis
PCR donde solo se amplifica una parte del gen y nos dice si esta o no el gen
PCR estandar o punto final
PCR utilzada para encontrar 2 o mas segmentos de DNA, nos dice si esta o no esta el gen
PCR multiplex
PCR que se hace con enzimas de restriccion que corta el DNA e identifica varios segmentos, no solo uno
PCR-RFLP
PCR que toma un RNA y hace su copia de DNA y ya despues se hace la PCR
RT-PCR o transcriptasa reversa
la PCR punto final es _ y la PCR tiempo real es _
cualitativa
cuantitativa
tecnica mediante la cual se separan las moleculas en disolucion cuando se ven sometidas a un campo electrico
electroforesis
elementos necesarios para una electroforesis
- camara de electroforesis
- gel de agarosa
- marcador de peso molecular
- transiluminadores ultravioleta
polisacarido extraido de algas marinas que separa fragmentos de DNA
gel de agarosa
los segmentos _ de DNA se quedan hasta arriba y los _ se quedan hasta abajo
los grandes arriba
los chiquitos abajo
la concentracion de agarosa es _ proporcional al tamaño del poro obtenido
inversamente
son una mezcla de moleculas de DNA o de proteinas de tamaño conocido que permiten determinar por comparacion el tamaño de las moleclulas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis
marcador de peso molecular
mediante esta PCR es posible cuantificar la cantidad de DNA en la muestra
PCR tiempo real
para el COVID se utilizan _ ciclos de PCR tiempo real
45 ciclos
elementos necesarios para la PCR tiempo real
- templado o DNA
- Taq pol
- desoxirribonucleotidos
- primers
- magnesio
- Buffer
- agua
- colorantes
los sistema reportero fluorescencia o colorantes pueden ser:
- especificos
- no especificos
colorante no especifico mas comun
SYBER green
colorantes que son sondas fluorescentes de oligonucleotidos con un reportero fluorescente
especificos
colorantes que son moleculas intercalantes que tienen afinidad por el dsDNA y generan una señal fluorescente
no especificos
tipos de cuantificacion del DNA
- absoluta
- relativa
cuantificacion que permite conocer el numero exacto de copias amplificadas del blanco, mide la concentracion precisa de ac nucleicos en una muestra y mide la carga viral o bacteriana de un tejido
absoluta
cuantificacion que evalua los cambios en la expresion de genes en distintos estados fisiologicos
relativa
tecnica que determina la presencia de un gen en una mezcla de acidos nucleicos extraidos con anterioridad
tecnica de Southern Blot
