9 - DNA Flashcards
Was für eine Auswirkung hat die Plasmidgröße?
In der Regel sollte das Plasmid so klein wie möglich sein.
- Ein großes Plasmid stellt eine metabolische Belastung für den E. coli-Wirt dar und pDNA-Ausbeute.
- Aus therapeutischer Sicht durchdringt ein kleines Plasmid die zellulären Hürden effizienter und
- zeigt erhöhte Expressionsraten
! Die Größe des Plasmids kann jedoch durch den therapeutischen Ansatz vorgegeben sein.
Welche Auswirkung hat die Wahl der wirtszelle? Und was wird oft gewählt?
Ausbeute und Qualität der pDNA werden maßgeblich durch den Produktionswirt beeinflusst. Sorgfältige auswahl ist kritisch!
Meistens werden für die pDNA-Herstellung Stämme verwendet, die von E. coli K12 abgeleitet sind, insbesondere DH1 oder DH5-alpha.
Welche Kriterien sollte ein Titer erreichen? Was ist der heutige maßstab?
-Gegenwärtig gilt ein Plasmidtiter von etwa 2,4 g/L als Maßstab
-Eine spezifische pDNA-Ausbeute von mehr als 40 mg/g Zelltrockengewicht kann bereits erreicht werden
- pDNA-Homogenität von
90% supercoiled Form am Ende der Kultivierung sollte das Ziel sein.
-> pDNA-Fermentation ist kein Engpass mehr
In welchen Formen kann die DNA vorliegen?
- lineare DNA
- offenkettige DNA
- supercoil form
Was sind die Herausvorderungen bei der Reinigung von DNA?
- hoher feststoffgehalt
- hohe viskosität
- scherempfindliche Feststoffe
- geringe chromatogrfische Kapazität
Wie ist die grobe E.Coli Zusammensetzung?
- 3% gDNA
- 3% pDNA
- 21% RNA
- 55% Proteine
- 3% LPS
- 15% anderes
Schritte der pDNA Herstellung und Reinigung?
- Fermentation
- Zellernte
- Zellaufschluss
- Klärung / Primäre Verwertung
- Chromatographie / Polieren / Pufferaustausch
- Formulieren
Welchen Einfluss hat die Zentrifugation bei der Zellernte?
Hat großen Einfluss auf die ausbeute.
- stoßweise Entladung der Zellen aus einer mit hoher Geschwindigkeit arbeitenden Zentrifuge führt zu mehr lysierten Zellen und degradiertem Plasmid.
Was macht die Alkalische Lyse (Zellaufschluss) aus?
-Im Wesentlichen ist die alkalische Lyse der erste Schritt der Downstream-Verarbeitung von pDNA, gefolgt von einer Reihe von Chromatographie- und Filtrationsschritten. Der Zweck der alkalischen Lyse ist die Freisetzung von pDNA aus der Biomasse.
-Die Zellen werden unter alkalischen Bedingungen (mit einem pH-Wert von etwa 12) lysiert und anschließend neutralisiert.
Die Folge ist eine Ausfällung und Ausflockung von Wirtsproteinen und genomischer DNA, wobei die Plasmid-DNA im Überstand löslich bleibt.
Überstand löslich bleibt.
- Im Labor- und Labormaßstab ist dieses Verfahren aus verfahrenstechnischer Sicht unkompliziert.
- Im großen Maßstab stellt jedoch die schonende Entfernung des Lysatniederschlags einen ernsthaften Engpass dar. Die mechanische Belastung führt zu einem erheblichen Verlust an supergespulter pDNA und zu einem erhöhten Gehalt an wirtsspezifischen Verunreinigungen, was zu einer geringeren Ausbeute sowie zu komplexen und kostenintensiven Reinigungsverfahren führt.
Wie verläuft die Ente Large-scale pDNA Aufspaltung
- Die Lyse erfolgt in einem röhrenförmigen Lyse-Reaktor, der mit Glasperlen gefüllt ist.
- Nach der Neutralisierung in einem Schlaufenreaktor wird das Präzipitat in einer Klärvorrichtung abgetrennt, die ebenfalls mit Glasperlen gefüllt ist.
- Dieses Lysesystem kann schnell betrieben werden, wodurch ein Plasmidabbau während der Verarbeitung vermieden wird (kein Verlust von supercoiled pDNA).
- Bis zu 95 % der ursprünglichen pDNA können aus der Biomasse zurückgewonnen werden, was zu einem geklärten Lysat (30-150 mg pDNA/L) führt, das direkt verarbeitet werden kann.
Wie läuft die Chromatographie und Aufreinigung von pDNA im Large-scale Prozess?
Erster Schritt: Hydrophobic interaction chromatography (HIC) -> gut für grundlegende Trennung (Endotoxine, RNA, genome DNA)
Nachfolgend: Anionen Austauschchromatographie (AEC) -> anstieg pDNA konzentration, Volumenreduktion, endotoxin-clearance
Wie läuft das Polieren und Formulieren von pDNA im Large-scale Prozess?
Ultrafiltration: von 1mg/mL -> zu 10mg/mL
! Plasmide stellen jedoch bei solchen Konzentrationen aufgrund der erhöhten Schüttgutviskosität eine verfahrenstechnische Herausforderung dar
