11 - Virus aufreinigung Flashcards
Wieviel Chromosomen hat ein Mensch?
Das größte Chromosom ist bis zu 10x größer als das kleinste.
Was ist ein Gen?
Ein Gen ist ein Bereich der DNA, der eine Funktion kodiert. Ein Chromosom besteht aus einem langen DNA-Strang mit vielen Genen. Ein menschliches Chromosom kann bis zu 500 Millionen Basenpaare DNA mit Tausenden von Genen enthalten
Welche DNA Viruse gibt es?
Doppelstrang und einfacher Strang.
Beim doppelstrang gibt es neben dem nicht umhüllten auch das umhüllte Virus.
Wie ist ein Virus aufgebaut?
Ein intaktes infektiöses Viruspartikel (oder Virion) besteht aus einem Genom, einem
Kapsid und möglicherweise einer Hülle
Wie werden Viren ohne Hülle genannt?
Einige Viren bestehen nur aus einem Genom, das von einem Kapsid umgeben ist, und werden als Nukleokapsid oder nackte Viren bezeichnet.
Welche Viren haben Hüllen und warum?
-Die meisten tierischen Viren haben eine Hülle, die ein polyedrisches oder schraubenförmiges Nukleokapsid umgibt. Diese Hülle entsteht in der Regel durch einen Knospungsprozess und wird von der Membran der Wirtszellen abgeleitet.
Diese werden als umhüllte Viren bezeichnet.
Wie ist die Oberfläche eines Virus?
Spezifische Proteine (Spikes, Spike-Protein) oder Glykoproteine auf der Virusoberfläche dienen dazu, Viren an die Oberfläche ihrer Wirtszelle zu binden.
Wo liegt der isoelektrischer Punkt von Viren?
Die IEPs von Viren liegen im pH-Bereich von 1,9 bis 8,4; am häufigsten werden sie in einem Bereich von 3,5 < IEP < 7 gemessen.
Allerdings scheinen die Daten innerhalb einzelner Virusspezies weit gestreut zu sein.
Diese Diskrepanz wird diskutiert und sollte berücksichtigt werden, wenn IEP-Werte verwendet werden, um den Sorptionsprozess von Viren zu berücksichtigen.
Wie kann die Vektorproduktion erfolgen?
Die Induktion der Vektorproduktion erfolgt entweder durch Transfektion, bei der die Zellen mit einem oder mehreren Plasmiden transfiziert werden (Helferfunktion und vektorkonstruktion).
Oder durch die Infektion der Zellen mit einem oder mehreren Viren, die die für die Produktion des viralen Vektors erforderlichen Funktionen bereitstellen.
Im Prinzip kann der transiente (oder induzierbare) Produktionsmodus für die Herstellung aller viralen Vektoren verwendet werden, einschließlich retroviraler Vektoren, wenn keine stabilen Produktionszelllinien zur Verfügung stehen.
Wann ist die Zellernte und was ist zu beachten?
Die Zellernte ist in der Regel die Schnittstelle zwischen vor- und nachgelagerten Prozessen. Der Zeitpunkt der Ernte (ToH) sollte so gewählt werden, dass
verschiedene Parameter wie die Produktqualität und nicht nur die Produktivität zu berücksichtigen.
Was passiert wenn man länger Kultiviert als sinnvoll?
Höhere Kulturzeiten führen zu einer geringeren Lebensfähigkeit der Zellen und damit zu einer höheren Partikelproduktion sowie zu einer Zunahme von Wirtszellproteinen, Wirtszell-DNA und Zelltrümmern, die den Reinigungsprozess belasten.
Was ist der unterschied zwischen MABs und Viren aufreinigungsprozessen?
Die Verfahren zur Reinigung von Antikörpern sind im Gegensatz zur Reinigung von Partikeln auf Virusbasis bereits gut etabliert.
Für Viren können allerdings mehrere Kombinationen und verschiedene Techniken eingesetzt werden.
Der Schritt der Sterilfiltration kann nicht für Partikel durchgeführt werden, die größer als 0,2μ sind. Ist also nur bei MABs nicht bei Viren möglich.
Vieren Vervielfältigung und Replikation?
- Anheftung: Durch endozytose gelangen vieren durch verschmelzen in die Zelle
- Eintritt: Einschließen des Virus in Vakuole
- Entschalung: Zelleigene Enzyme streifen Proteinhülle von Virus ab -> Genomfreisetzung
- Transkription/ mRNA Produktion: Infizierte RNA produziert Boten-RNA (mRNA) -> Genom zu Proteinprodukt
Oder bei -RNA -> Transkription dann Translation - Synthese von Virusbestandteilen.
- Aufbau eines Virons
- Freisetzung
Größe Viren ?
18-300 nm
Größe Bakterien? E.Coli?
1-2 my Ecoli: 1-3 ym
Größe Proteine?
1-10 ym
Größe Pflanzenzellen?
60-100ym
Größe Zellbruchstücke?
0,2 -0,5 ym
Wo liegt der isoelektrische Punkt von Viren, mAb, Zellen und DNA?
Viren: 3,5-7
mAb:7,5-9
Zellen: 3-5
DNA: 2-3
Welche Verunreinigungen müssen bei der Virenaufreinigung entfernt werden?
- Leere Kapside
- virale Partikel, die ein anderes genetisches material einkapseln
- gebrochene/ zerlegte Partikel
- Virus DNA Aggregate
- Extrazelluläre Versikel
Wie sind Tiefenfilter für die Aufreinigung von mAbs und Viren geladen?
mAbs: neutral-basisch geladen
Viren: neutral-sauer geladen
Was bestimmt die ersten schritte eines Aufreinigungsprozess?
Die ersten Schritte des Reinigungsprozesses werden stark von den Merkmalen der Bioreaktormasse, insbesondere der Zelldichte und der Lebensfähigkeit, beeinflusst,
oder von der Art des freigesetzten Produkts, das entweder durch Knospung oder Zelllyse freigesetzt wird.
Wie kann eine Zelle Aufgebrochen werden um an die intrazellulären Produkte zu kommen?
Die Zelllyse kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden:
- Einfrieren und Auftauen,
- Detergenzien (Triton X 100),
- Homogenisator,
- Sonikation,
Was ist DGC zur aufreinigung?
Die Dichtegradientenzentrifugation (DGC ) ist eine bekannte und
etablierte, klassische Aufreinigungstechnik, die im Allgemeinen zur Aufreinigung begrenzter Mengen.
Das Prinzip ist die Trennung von Partikeln aufgrund von Dichteunterschieden und damit, wenn sie auf Viren angewendet wird, in der Trennung von leichterem und schwererem zellulärem Material.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Konzentrations- und Reinigungsschritte in einem einzigen Arbeitsgang kombiniert werden können. Aus betrieblicher Sicht ist die Technik jedoch sehr arbeitsaufwändig und in der Größenordnung sehr teuer.
Welche Chromatographie adsorber arten gibt es zur aufreinigung von Viren? Was ist das Problem bei regulären Adsorbern?
Festbetten, Membranadsorber und Monolithen.
Viren haben eine Größe von 30 nm bis 300 nm oder noch größer und können daher nicht in die Poren der meisten handelsüblichen Adsorberharze diffundieren.
Welche Chromatographiemethoden können für Viren verwendet werden?
Alle auf Adsorption basierenden Methoden können zur Reinigung von Viren eingesetzt werden
- Affinität
- Sulfatierte Cellulose / Heparin
- Linker-basiert
- Elektrostatische Wechselwirkung
- Hydrophobe Wechselwirkung
- Gemischter Modus / Hydroxy-Attitüde
- Größenausschluß
- Multimodal
Was ist der Vorteil von CaptoTM Core 700 und CaptoTM Core 400 Harzen? + Aufbau?
Diese Harze eignen sich für die Durchfluss-Chromatographie, da sie die Verunreinigungen effizient binden können, während die Zielpartikel das Harz passieren und im Durchfluss gesammelt werden.
Diese haben einen ligandenaktivierten Kern und eine inaktive Schale.
Welches ist die herausstechende Chromatographie für die aufreinigung und warum?
Affinitätschromatographie aufgrund ihrer einzigartigen Selektivität
Affinitätschromatographie aufgrund ihrer einzigartigen Selektivitätskapazitäten bei der Herstellung von Bio-Therapeutika an Bedeutung gewonnen hat.
