6. Domaćini i vektori u GI 1.DIO Flashcards
Što su vektori?
DNA molekule u koje se jednostavno može integrirati (insertirati, ugraditi) fragment
DNA koji želimo klonirati (insert) u svrhu umnažanja, replikacije u odgovarajućem domaćinu
Što je domaćin? Koji je univerzalni domaćin a u kojim slučajevima biramo neki drugi?
organizam (najčešće bakterija E. coli) koji se koristi za umnažanje, replikaciju vektora odnosno vektora s insertom
Escherichia coli je univerzalni domaćin za kloniranje
kada je to potrebno, koriste se i neki drugi mikroorganizmi - npr ako je genski produkt gena kojeg želimo replicirati toksičan za bakteriju E. coli
Koriste li se za ulogu domaćina divlji sojevi E. coli?
⚫ ne koristi se divlji tip nego odgovarajući sojevi (mutanti, GMM)
* imaju mutacije/modifikacije koje ih čine dobrim domaćinima
* različiti sojevi i mutacije za različite namjene
Opiši oznake genotipa u bakterije E.coli.
⚫ navode se samo geni koji su mutirani (Demerec, 1966) - aleli gena koji nisu uobičajeni za organizam
⚫ označavaju se s tri mala slova kojima se može dodati jedno veliko slovo i to u kurzivu ili
podcrtano: recA ili recA
⚫ iza oznake gena mogu se dodati “+” ili “-” da se naglasi da li je navedeni gen divljeg tipa
ili je mutiran: recA+ ili recA-
⚫ oznake “+” i “-” navode se i uz oznaku fenotipa: Lac+ ili Lac-
⚫ specifični alel nekog gena označava se brojem: leuB6
⚫ prisutnost ili odsutnost F-faktora navodi se na početku opisa genotipa:
* F’, F- , F+ , Hfr
⚫ prisutnost profaga i plazmida označava se zagradama: F’[proAB+]
⚫ oznaka Δ označava deleciju: Δ(lac-proAB)
⚫ rezistencija – oznaka fenotipa: StrR, AmpR , BleR , TetR , NalR , EryR . . .
⚫ inaktivacija gena insercijom: leuB::Tn10(TetR)
Koje su uobičajene mutacije E.coli?
dam – metilacija GATC sekvencije
dcm – metilacija CCWGG sekvencije
hsdR – restrikcija u hsd RM-sustavu (r-m+) – (restrikcijski enzimi 1. skupine)
hsdS – restrikcija i modifikacija u hsd RM sustavu (r-m-) – (rest. enz. 1. skupine)
mcrA; mcrBC – restrikcija sekvencija s modificiranim citozinom
mrr – restrikcija sekvencija s modificiranim citozinom i adeninom
lacZ – kodira za za β–galaktozidazu
Δ(lac-proAB) – delecija fragmenta od lac operona do operona proAB
recA – homologna rekombinacija, SOS-odgovor
recF i recJ – homololgna rekombinacija među plazmidima
ung – kodira za uracil-N-glikozidazu
dut – kodira za dUTPazu
Što su shuttle vektori?
vektori koji se mogu koristiti (umnažati, replicirati) u dva ili više različitih organizama (npr. E. coli i S. cerevisiae)
Koja su osnovna svojstva dobrog vektora?
⚫ samostalna replikacija u bakteriji E. coli
⚫ mala molekulska masa (nekoliko kb)
⚫ veliki broj kopija po stanici (nekoliko stotina)
⚫ jednostavna izolacija iz bakterije E. coli
⚫ više jedinstvenih mjesta za restrikcijske enzime
⚫ polilinker, višestruko mjesto za kloniranje, “multiple cloning site”, MCS
⚫ jednostavna selekcija stanica koje sadrže vektor (najčešće rezistencija
na neki antibiotik)
⚫ jednostavna selekcija vektora koji sadrže insert
Kako se vektori dijele obzirom na podrijetlo?
⚫ plazmidne vektore
⚫ virusne vektore
⚫ kombinaciju plazmidnih i virusnih vektora (plazmidno-virusni vektori)
⚫ umjetne kromosome (YAC, BAC)
Nabroji neke plazmidne vektore.
pSC101
pBR322
pUC18, pUC19, pTZ18/19, pGEM . . .
Koji je prvi plazmid korišten kao vektor, opiši ga.
pSC101
⚫ prvi plazmid koji je korišten kao vektor (1973.)
⚫ prirodni plazmid u bakteriji Salmonalla panama
⚫ samo do 5 molekula po stanici E. coli
⚫ gen za rezistenciju na antibiotik tetraciklin i ishodište replikacije
⚫ više od 9 kb
Nešto o plazmidu pBR322.
pBR322
⚫ konstruiran 1977.
⚫ manje od 4,5 kb; rezistencija na dva antibiotika - ampicilin i tetraciklin
⚫ oko 20 plazmida po stanici E.coli
- rep - gen za replikaciju plazmida
-rop - gen za regulaciju broja kopija plazmida
Opiši neke karakteristike suvremenih plazmida.
-pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pTZ18/19, pGEM . . .
mutacije u genu za RNA I ili RNA II
⚫ 500 do 700 molekula po stanici pri 37°C
⚫ ~20 molekula po stanici pri 30°C
male dimenzije – često manje od 3 kb
polilinker (MCS, multiple cloniong site)
⚫ kratka “umjetna” sekvencija (50ak pb) koja sadrži jedinstvena restrikcijska
mjesta za 10 do 20 pa čak i više restrikcijskih enzima
lacZ – kodira za β-galaktozidazu, omogućava jednostavan odabir kolonija koje
sadrže plazmid s insertom
⚫ osniva se na intraalelnoj (intragenskoj) komplementaciji
⚫ α-komplementacija
⚫ selekcija/sustav plavo-bijelo
Merlin ?!?
mutacije u genu za RNA I ili RNA II
⚫ 500 do 700 molekula po stanici pri 37°C
⚫ ~20 molekula po stanici pri 30°C
male dimenzije – često manje od 3 kb
polilinker (MCS, multiple cloning site)
⚫ kratka “umjetna” sekvencija (50ak pb) koja sadrži jedinstvena restrikcijska
mjesta za 10 do 20 pa čak i više restrikcijskih enzima
lacZ – kodira za β-galaktozidazu, omogućava jednostavan odabir kolonija koje
sadrže plazmid s insertom
⚫ osniva se na intraalelnoj (intragenskoj) komplementaciji
⚫ α-komplementacija
⚫ selekcija/sustav plavo-bijelo