5. PCR, qPCR, RAPD

Question 1

Kakve DNA polimeraze se koriste u PCR metodi? Navedi primjere.

Answer 1

 Termorezistentne DNA-polimeraze
⚫ Taq (Thermus aquaticus)
⚫ Tfl, Pfu, Vent . .

Question 2

Navedi primjenu PCR.

Answer 2

 Primjena
⚫ umnažanje (detekciju) točno određenog dijela genoma (DNA) iz male količine
genetičkog materijala (teoretski dovoljna samo jedna dvolančana molekula)
⚫ detekcija RNA moguća je uz upotrebu reverzne transkriptaze

Question 2

Opiši sastav reakcijske otopine pri metodi PCR.

Answer 2

 Sastav reakcijske otopine (najčešće 50 ili 100 μL)
⚫ DNA-kalup
⚫ početnice (1 pM/μL)
⚫ dNTP-ovi (200 pM/μL)
⚫ polimeraza (1-5 U)
⚫ pufer za polimerazu, Mg2+ (1x)

Question 3

Objasni princip metode PCR.

Answer 3

 Princip metode
⚫ dvije klice, oligonukleotida (eng. “primer”, početnice, začetnice)
* 12-30 nukleotida (jednolančana DNA)
* komplementarno se sparuju „lijevo i desno” od dijela DNA kojeg želimo umnožiti
* 3’-krajevi klica moraju biti orijentirani jedan prema drugome

Prvo DNA molekulu denaturiramo zagrijavanjem otopine na oko 95°C, dobivamo ssDNA. Otopinu hladimo na temperaturu annealiga (50-65°C) odn komplementarnog sparivanja početnica sa kalupom i početnice su dodane u velikom suvišku. Nakon toga otopinu zagrijavamo na 70-72°C da bi priredili optimalne uvijete za termostabilnu DNA polimerazu. Ona prepoznaje 3’ kraj početnice i radi sintezu sve dok je temperatura optimalna. iz jedne molekule nastaju dvije i gotov je prvi ciklus PCR. Cijeli ciklus se ponavlja nekoliko puta oko 30.

Question 4

Koji su uvjeti za provođenje PCR-a.

Answer 4

 Uvjeti reakcije
⚫ početna denaturacija DNA – 5 min, 94-95°C
⚫ denaturacija DNA – 30 s, 94-95°C
⚫ komplementarno sparivanje početnica (“annealing”) – 50-65°C (5-20°C ispod Tm), 1 min
⚫ sinteza DNA – 70-72°C, vrijeme ovisi o duljini fragmenta (~1min/kb)
⚫ završna sinteza DNA – 10 min

Question 5

Koji problemi se javljaju pri upotrebi PCR metode?

Answer 5

 Problemi
⚫ prijenos topline s “termo bloka” na otopinu u kiveti ovisi o uređaju, kiveti, volumenu uzorka
* kapilarni uređaji (brži prijenos topline)
⚫ pojava “parazitskih bandova” - nespecifično započinjanje reakcije
* polimeraza se dodaje tek nakon početnog zagrijavanja
* “hot start”-polimeraze”
⚫ Taq polimeraza ima nisku vjernost replikacije (uvodi mutacije)
* polimeraze s lektorirajućom 3’→ 5’ egzonukleaznom aktivnošću
⚫ rutinski se umnažaju kratki fragmeti (do maksimalne duljine od 2 do 3 kb)
* za umnažanje fragmenata duljih od 2 do 3 kb koriste se posebne DNA-polimeraze (procesivne polimeraze)

Question 5

Što sve vidimo na gelu ako nakon PCRa provedemo elektroforezu?

Answer 5

Intenzivnu vrpcu fragmenata kojeg smo htjeli umnožiti, nekoliko slabih parazitskih vrpci te slabe vrpce koje su najdalje migrirale (primeri)

Question 6

Može li se na temelju intenziteta vrpce umnožene PCRom odrediti količina (broj molekula) DNA koje su korištene kao kalup za PCR?

Answer 6

Teoretski može. Preko intenziteta vrpce, usporedbom sa standardom možemo doći do mase uzorka DNA. Iz mase uzorka DNA možemo doći do konačnog broja dvolančanih molekula nakon PCRa te izvrtanjem več poznate formule možemo izračunat početni broj molekula DNA. M0=M/2^n.
No to je teoretski iznos. Da bi stvarno to odredili koristimo RT-PCR ili Q-PCR.

Question 7

Primjena RT-PCR i qPCR? Koji je princip

Answer 7

određivanje udjela pojedinih molekula DNA u nekom uzorku – između ostalog,
omogućava određivanje udjela GMO u nekom proizvodu, udjela nekog mikroorganizma u
mješovitoj populaciji itd
Princip:
⚫ Praćenje umnažanja DNA u realnom vremenu na temelju povećanja fluorescencije
⚫ Najčešće se koristi m etoda TaqMan

Question 8

Objasni TaqMan metodu.

Answer 8

U TaqMan metodi koristi se Taq sonda, ssDNA koja na krajevima fluoruscentne jedinice. Ta sonda komplementarno se sparuje s jednim lancem kalupa točno između mjesta gdje bi se primeri trebali vezati, odnosno veže se u regiji DNA koja se mora umnažat. Fluorescentne jedinice označavaju se sa R i Q. jedna je reporter a druga quencher (prigušivać). Q prigušuje R kada se nalaze u blizini (kada se nalaze obje na TaqMan sondi). Kada je sonda vezana za DNA i kreće sinteza lanaca od primera, s vremenom polimeraza dolazi do sonde, sudara sa sondom te počinje su hidrolizirat da bi mogla nastavit polimerizirat lanac iza sebe. Hidrolizom sonde R i Q više nisu u blizini, Q ne prigušuje R te raste fluorescencija koju uređaj s vremenom detektira. Što je veča početna količina DNA ranije se postigne kritična vrijednost fluorescencije.

Question 9

Što je polimorfna DNA?

Answer 9

DNA koja dolazi u više oblika, postoje razlike na nivou redoslijeda nukleotida, a
razlike uzrokuju mutacije.

Question 10

Što je RAPD te koji je princip?

Answer 10

RAPD-PCR
 “Randomly Amplified Polimorphic DNA” - Slučajno umnožena polimorfna DNA
 Osniva se na metodi PCR
 Princip
⚫ PCR se provodi pri uvjetima koji omogućuju da se početnice vežu na više mjesta
(manje specifično sparivanje početnice i kalupa)
* kraće početnice
* sparivanje početnice i kalupa provodi se pri znatno nižoj temperaturi
* veća koncentracija Mg2+
⚫ može se koristiti samo jedna ili više početnica

Question 11

Što je prednost RAPD-PCR?

Answer 11

brzo, jeftino, informativno uspoređivanje sojeva/uzoraka DNA.