4. Enzimi u GI Flashcards
Na koje skupine dijelimo enzime koji se koriste u GI? Navedi primjere
Dijelimo ih na restrikcijske enzime (restrikcijske endonukleaze) i modifikacijske enzime (sve osim restrikcijskih - DNA-ligaze, RNaze, DNaze, DNA-polimeraze, fosfataze, polinukleotid-kinaze, terminalna deoksinukleotidil transferaza, RNA-polimeraze)
Što je DNA-ligaza te koje su njene upotrebe u GI?
- enzimi koji stvaraju fosfodiesterske veze u molekuli DNA između 5’-fosfatne i 3’-hidroksilne skupine
upotreba u genetičkom inženjerstvu (GI) – najčešće ligacija vektora i inserta
⚫ povezivanje linearnih molekula DNA
⚫ cirkularizacija linearnih molekula DNA
⚫ ligacija jednolančanih lomova (“nickova”)
Koji su supstrati za DNA-ligazu?
-dvolančana DNA s jednolančanim lomovima (“nick”) – najbolji supstrat
-molekule DNA s kompatibilnim (kohezivnim, “ljepljivim”) krajevima
-molekule DNA s ravnim (“blunt”) – samo neke (manje uspješno)
Navedi primjere DNA-ligaze te ih malo opiši.
-T4 DNA-ligaza
⚫ komercijalno najvažnija; iz bakteriofaga T4; koristi ATP kao koenzim
⚫ ligira ljepljive i ravne krajeve DNA
- DNA-ligaza iz E. coli
⚫ kao koenzim koristi NAD+; ne može ligirati ravne krajeve
Kakve krajeve ligira T4 DNA-ligaza?
i ljepljive i ravne
Kakve krajeve ligira DNA-ligaza iz E.Coli
samo ljepljive, ne može ligirati ravne krajeve
Što je potrebno da bi DNA-ligaza mogla ligirati DNA?
Mora postojati fosfatna skupina na 5’ kraju
Objasni reakciju ligacije jednolančanog loma pomoću T4 DNA-ligaze.
T4 DNA ligaza aktivira se ATP-om. Enzim-adenilat veže se na 5’ kraj DNA difosfatnom vezom i nastaje kompleks, dolazi do nukleofilnog napada 3’ OH skupine na fosfatnu skupinu na 5’ kraju i nastaje fosfodiesterska veza, odvaja se AMP.
Objasni postupak kloniranja HindIII-HindIII fragmenta bakteriofaga lambda veličine 6,6kb.
Plazmid i DNA bakteriofaga cijepamo restrikcijskim endonukleazama HindIII. Provodimo elektroforezu da bi vidjeli je li restrikcija uspjela. Za plazmid kao kontrolu koristimo nepocjepan plazmid i vidimo dva benda (OC i SC plazmid), kod pocjepanog plazmida vidimo jedan bend koji ukazuje na linearizaciju plazmida (vektori najčešće nisu 100% pocjepani, moguća pojava slabog benda za nepocjepan vektor). Kod uzorka DNA bakteriofaga vidimo puno bendova različite veličine (uspješna restrikcija). Nakon toga trebamo izolirati insert (naš fragment od 6,6kb) te trebamo izolirati vektor (da uklonimo vektore koji nisu pocjepani pošto vektor nije 100% pocjepan). Elektroforezom provjerimo uspješnost izolacije naših inserta i plazmida. Iz otopina inserta i plazmida trebamo ukloniti retrikcijske enzime da zaustavimo neželjenu restrikciju. Možemo miješati insert vektor i ligazu no ovdje dolazi do problema da će većinom doći do religacije vektora. Postoje dva rješenja. Jedno je da dodamo puno više inserta neko vektora (20 puta više), veća vjerojatnost da se insert i vektor približe i usmjere pravilno. Osim toga možemo sa 5’ kraja vektora ukloniti fosfatnu skupinu (polinukleotid fosfataza) što znači da taj kraj više nije supstrat za DNA ligazu i neće se moći religirati. Prije provođenja ligacije vektora i inserta moramo iz otopine vektora uklonit fosfataze (termostabilan je znači ne temp, nego sprječavanje kontakta enzima i DNA npr taloženje DNA). Nakon što imamo čiste otopine vektora inserta možemo pripravit ligacijsku otopinu. Plazmidima provodit transformaciju E.Coli te provjeriti transformante (izolacija i analiza plazmida)
Što je banka gena? kako ju još nazivamo?
Banka gena, knjižnica gena ili genomska banka je skup klonova (najčešće bakterije E.coli ili kvasca S.cerevisiae) koji sadrže
vektore (najčešće plazmide ili umjetne kromosme) u kojma su klonirani
(ugrađeni, insertirani) svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma (npr.
čovjeka) – u jednom klonu u pravilu se nalazi jedan fragment genoma
što je cDNA banka?
banka gena koja sadrži kodirajuću DNA (ORFove) nekog organizma
što je genomska banka?
banka gena koja sadrži kodirajuću i nekodirajuću DNA
Kada je banka gena potpuna?
banka je potpuna ako je u njoj sadržan željeni dio genoma (npr cjelokupna
cDNA ili cjelokupni genom)
Koje RNaze znamo?
RNazu A i RNazu H
Koje DNaze znamo?
nukleaza S1, Bal 31, DNaza I i egznukleaza II
Koje DNA- polimeraze znamo?
DNA-polimeraza I, Klenow fragment, Taq, reverzna transkriptaza
Što je RNaza A i kakvu aktivnost ima
-endoribonukleaza (izolirana iz goveđeg pankreasa) (cjepa unutar lanca)
aktivnost - cijepa fosfodiestersku vezu u jednolančanoj RNA ostavljajući 3’-
fosfatnu grupu na pirimidinskim nukleotidima (fosfatna skupina je inače na 5’ kraju)
Koja je primjena RNaze A?
Pri izolaciji DNA, rnaza a uklanja hidrolizira RNA
RNaza H aktivnost?
izolirana iz bakterije E. coli
- aktivnost
- cijepa RNA do kratkih oligoribonukleotida i to samo ako se RNA nalazi u DNA/RNA-
hibridu
- ne hidrolizira fosfodiesterske veze u ssDNA, dsDNA, ssRNA i dsRNA
nukleaza S1 i njena aktivnost?
izolirana iz plijesni Aspergillus oryzae
aktivnost
⚫ hidrolizira i jednolančanu DNA i jednolančanu RNA do 5’-fosforil mono- ili
oligonukleitida, ali:
* ima 5x veću aktivnost na DNA nego na RNA
* ako se nalazi u velikom suvišku hidrolizira i dsDNA
* najslabiju aktivnost ima na DNA/RNA-hibridu
⚫ aktivna je pri niskom pH (4,5) i u prisutnosti Zn2+
Primjena RNaze H?
Primjenjuje se u pripremi cDNA reverznom transkripcijom. Iz mRNA sintetizira se lanac DNA i imamo RNA/DNA hibrid. to je supstrat za RNazu H te RNaza H cijepa RNA do kratkih oligonukleotida i uklanja RNA iz hibrida, nastaje ssDNA. DNA-polimeraza sintetizira drugi lanac i imamo dsDNA
Može li nukleaza S1 hidrolizirati dsDNA?
SAMO ako se dsDNA nalazi u velikom suvišku
Na kojem supstratu ima najveću a na kojem najmanju aktivnost nukleaza S1?
Najveću na ssDNA a najmanju na DNA/RNA hibridu
koje su primjene nukleaze S1?
⚫ uklanjanje jednolančane DNA s krajeva dvolančanih fragmenata
⚫ S1-mapiranje
Što je S1- mapiranje, objasni princip metode.
metoda koja se koristi za određivanje broja i duljine egzona nekom genu
Princip metode
⚫ mRNA se pomiješa s denaturiranom ili jednolančanom DNA
* mRNA se komplementano sparuje s odgovarajućim genom (DNA)
⚫ otopina koja sadrži RNA/DNA hibrid tretira se nukleazom S1
⚫ u smjesi zaostaje samo DNA/RNA-hibrid
* elektroforeza (broj i veličina fragmenata)
* fragmenti su zapravo egzoni
⚫ kloniranje egzona
* prevođenje RNA/DNA hibrida u dsDNA
* tretiranje RNazom H i sinteza komplementarnog lanca DNA
* insercija dsDNA u vektor, transformacija E.coli, izolacija plazmida,
sekvencioniranje inserta . .
Objasni aktivnost nukleaze BAL 31.
aktivnost
⚫ hidrolizira DNA do 5’-fosforil-mononukleotida
⚫ egzonukleazna aktivnost prema dsDNA (hidrolizira 5’- i 3’-kraj)
⚫ ostavlja ravne krajeve
Koja je primjena nukleaze BAL 31?
primjena
⚫ skraćivanje dsDNA sa njenih krajeva
npr. detekcija promotora - kloniramo fragmente različite duljine i provodimo in vitro transkripciju, kada se transkripcija više ne dešava načeli smo promotor
Objasni aktivnost DNaze I.
izolirana iz goveđeg pankreasa
aktivnost
⚫ endonukleaza koja hidrolizira jednolančanu i dvolančanu DNA ostavljajući fosfatnu skupinu na 5’-kraju
⚫ aktivnost joj ovisi o prisutnosti Ca2+, a može se modulirati prisustvom Mg2+ (MgCl2) i Mn2+ (MnCl2)
* Mg2+ - nasumice uvodi jednolančanelomove
* Mn2+ - nasumično uvodi dvolančane lomove (djeluje kao nespecifični restrikcijski
enzim)
Navedi primjenu DNaze I.
primjena – u prisustvu Mn2+
⚫ fragmentiranje dsDNA (priprema knjižnice gena)
primjena – u prisustvu Mg2+
⚫ uvođenje jednolančanih lomova (supstrat za DNA-polimerazu I)
* obilježavanje DNA (radioaktivno ili neradioaktivno)
⚫ u velikim koncentracijama potpuno hidrolizira DNA
* primjena pri izolaciji RNA
* uklanjanje kalupa nakon in vitro transkripcije
⚫ istraživanje interakcije DNA i proteina (“DNaze I footprinting”)
* mogu se detektirati sekvencije DNA na koje se veže određeni protein jer DNaza ne može razgraditi DNA na koju je protein vezan
* DNaza I doda se u otopinu DNA i odgovarajućeg proteina
Objasni obilježavanje DNA korištenjem enzima DNaze I i DNA polimeraze I.
DNaza I u prisutstvu Mg2+ iona nasumice uvodi jednolančane lomove. DNA sa jednolančanim lomom je supstrat za DNA polimerazu I koja svojim aktivnostima provodi nick translation, pomak zareza. DNA polimeraza I pomoću 5’-3’ polimeraznom aktivnošću produljuje 3’ kraj jednolančanog loma, a sa 5’-3’ nuleaznom aktivnošću cijepa fosfodiesterske veze i uklanja nukleotide na svom putu (iza sebe polimerizira, a ispred sebe hidrolizira). Kao supstrat u ovoj reakciji mogu se koristiti radioaktivni nukleotidi čime će cijeli novi sintetiziran fragment DNA bit radioaktivno obilježen. Pri tome u nukleotidu je radioaktivan alfa-fosfat (on sudjeluje u fosfodiesterskoj vezi).
Navedi primjene egzonukleaze III.
primjena
⚫ skraćivanje linearnih fragmenata dsDNA na samo jednom kraju
* restrikcija, egzonukleaza III, nukleaza S1
⚫ priprema (dobivanje) jednolančane kružne DNA
* Nb.Bpu10I (Fermentas) i egzonukleaza III (uvedemo jednolančani lom nekim enzimom te koristimo egzonukleazu III koja će poslijedićno degradirati cijeli lanac kružne DNA)
Objasni aktivnost egzonukleaze III.
izolirana iz bakterije E. coli
enzimska aktivnost: 3’-5’-egzonukleaza na dsDNA
⚫ aktivna je na:
- jednolančanim lomovima
- ravnim krajevima
- isturenim jednolančanim krajevima, ali:
* nije aktivna na 3’-isturenim krajevima duljim od 3 nukleotida ni ss DNA
Objasni građu DNA polimeraze I.
N-terminalni dio proteina (~30%) ima 5’-3’-nukleaznu aktivnost
C-terminalni dio (~70%) ima 5’-3’-polimeraznu i 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost – Klenow fragment (Klenow-polimeraza; Klenow enzim)
⚫ 5’-3’-nukleazna aktivnost je nepoželjna u mnogim metodama GI
⚫ 3’-5’-nukleazna lektorirajuća aktivnost je poželjna jer povećava vjernost sinteze DNA
⚫ nema 5’-3’-nukleaznu aktivnost
i DNA-polimeraza I i Klenow fragment
⚫ mogu koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
⚫ primjena – označavanje DNA
Objasni aktivnost DNA polimeraze
izolirana iz bakterije E. coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza
⚫ za sintezu potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTP-ovi i Mg2+
aktivnosti
⚫ 5’-3’-polimerazna aktivnost
⚫ 3’-5’-nukleazna aktivnost (“proofreading”, lektoriraluća aktivnost)
* stimulirana zadnjim nesparenim nukleotidom na 3’-kraju
⚫ 5’-3’-nukleazna aktivnost (na jednolančanim lomovima)
* produljuje 3’-kraj i degradira 5’-kraj (“nick-translation”)
⚫ ribonukleazna aktivnost (slično kao RNaza H)
Objasni aktivnost Taq polimeraze.
izolirana iz Thermus aquaticus; rekombinantna iz E.coli
DNA-ovisna DNA-polimeraza (za sintezu su potrebni kalup, klica sa slobodnom 3’-OH
skupinom, dNTP-ovi i Mg2+)
aktivnosti
⚫ ima 5’-3’ polimeraznu aktivnost
⚫ nema 3’-5’ egzonukleaznu aktivnost
⚫ ima jako slabu 5’-3’-egzonuklezanu
⚫ ostavlja 3’-istureni dA na 3’-kraju
termostabilna
⚫ vrijeme “poluživota” na 95°C je više od 40 minuta
može koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
Što je Klenow fragment?
C-terminalni dio DNA polimeraze I (~70%) ima 5’-3’-polimeraznu i 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost – Klenow
fragment (Klenow-polimeraza; Klenow enzim)
⚫ 5’-3’-nukleazna aktivnost je nepoželjna u mnogim metodama GI
⚫ 3’-5’-nukleazna lektorirajuća aktivnost je poželjna jer povećava vjernost sinteze DNA
⚫ nema 5’-3’-nukleaznu aktivnost
i DNA-polimeraza I i Klenow fragment
⚫ mogu koristiti modificirane nukleotide (fluorescentne, sa digoksigeninom)
⚫ primjena – označavanje DNA
Primjena Taq polimeraze?
primjena
⚫ “Polymerase Chain Reaction” (PCR) – lančana reakcija polimerazom
⚫ AT-kloniranje
* koristi se linearni vektor koji ima istureni T na 3’-kraju
Što je AT kloniranje, zašto se koristi te koje su prednosti?
Objasni reverznu transkriptazu te njenu uporabu.
RNA-ovisna DNA-polimeraza
⚫ polimerizira DNA na kalupu RNA
izolirana iz retrovirusa; modificirana i klonirana u E.coli
upotreba – konstrukcija cDNA biblioteka
⚫ izoliranu RNA propustiti kroz kolonu koja sadrži oligo-dT (veže se samo mRNA jer
sadrži poliA) te mRNA eluirati s 0,1 M NaCl
⚫ dodati oligo-dT i reverznu transkriptazu – DNA/RNA-hibrid
⚫ dodati RNazu H, DNA-polimerazu I, dNTPove
⚫ stvaranje ravnih krajeva, ligacija i ligacija s vektorom
Navedi najčešće primjene DNA polimeraza i DNaza u GI.
Najčešće primjene
⚫ sinteza DNA prema kalupu (obilježavanje DNA – kemijski modificirani i
radioaktivni nukleotidi)
⚫ pretvaranje 5’- i 3’-krajeva u ravne krajeve (DNA polimeraza I, nukleaza S1)
⚫ PCR – termostabilne polimeraze
⚫ cDNA – reverzna transkriptaza
Objasni polinukleotid kinazu i fosfatazu te njihove primjene.
Polinukleotid fosfataza
⚫ uklanja fosfatnu grupu s 5’-kraja ss i ds DNA i RNA
Polinukleotid kinaza
⚫ katalizira prijenos gama fosfata s ATP na 5’-OH skupinu ss i ds RNA i DNA
primjena
⚫ radioaktivno bilježavanje 5’-kraja DNA
⚫ sprječavanje religacije vektora (povećanje uspješnosti kloniranja)
terminalna deoksinukleotidil transferaza aktivnost i primjena.
izolirana iz goveđeg timusa
aktivnost
⚫ polimerizira deoksinukleotide na slobodnu 3’-OH skupinu ss i dsDNA
upotreba
⚫ obilježavanje DNA na 3’-kraju
⚫ izrada knjižnica gena (npr: fragmentiranje genoma s DNazom I, na fragmente se
doda poli-dA, a na linearizirane plazmide poli-dT . . .)
