2. Restrikcijske endonukleaze

Question 1

Što su restrikcijske endonukleaze/ restrikcijski enzimi?

Answer 1

Enzimi koji omogućuju fragmentiranje DNA na točno određenom mjestu.
Neophodan „alat” u genetičkom inženjerstvu
-omogućavaju nam da fragmentiramo/režemo/cijepamo/presijecamo dsDNA –„restrikcija”
-„molekularne škare za dsDNA”

Question 2

Od kuda potječu restrikcijske endonukleaze?

Answer 2

Potječu iz bakterija – dio su restrikcijsko-modifikacijskih sustava (RM-sustavi) kojim se bakterije štite od bakteriofaga i strane DNA
* cijepaju stranu DNA – restrikcija
* vlastitu DNA štite od restrikcije metilacijom baza - modifikacija

Question 3

Kako djeluju RM-sustavi?

Answer 3

Prepoznavanje točno određene sekvencije u dsDNA (najčešće 4 ili 6 pb)
-ako je prepoznata sekvencija:
* nemetilirana – restrikcija
* hemimetilirana – metilacija
* metilirana – nema aktivnosti

Question 4

Otkriće RM-sustava?

Question 5

Kako dijelimo restrikcijske endonukleaze?

Answer 5

Podijeljene u nekoliko skupina (I, II, IIS, III i IV)

Question 6

Koje endonukleaze imaju najveću primjenu?

Answer 6

Najveću primjenu imaju restrikcijske endonukleaze skupine II
-„restrikcijski enzimi” u genetičkom inženjerstvu, mol.gen., mol.biol…
-cijepaju dsDNA unutar specifične simetrične sekvencije
* najčešće „palindromske sekvencije” duljine 4 i 6, rjeđe 8 pb

Question 7

Palindromi u molekuli DNA?

Answer 7

Komplementarni lanci, u smjeru iste polarnosti, imaju isti redoslijed nukleotida
-Imaju os simetrije - ako palindromsku sekvenciju “okrenemo” za 180° redoslijed nukleotida ostaje nepromijenjen
-susjedne baze (u istom lancu DNA) u centru palindroma uvijek su međusobno komplementarne (AT, TA, GC, CG); dvije baze koje su jednako udaljene od centra palindroma uvijek su komplementarne

Question 8

Kako restrikcijski enzimi mogu cijepati DNA? Nabroji primjere za svaki.

Answer 8

-mogu ostavljati 5’-jednolančane krajeve (XhoI, SalI, Csp6I, MboI)
-mogu ostavljati 3’-jednolančane krajeve (SacI, SacII)
-mogu ostavljati “ravne” krajeve (SspI, ScaI)

Question 9

Što su izoshizomeri?

Answer 9

Različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju - RsaI i Csp6I

Question 10

Što su striktni izoshizomeri?

Answer 10

Različiti enzimi koji cijepaju istu sekvenciju na isti način - MboI i Bsp143I

Question 11

U kojim slučajevima se fragmenti DNA mogu ligirati?

Answer 11

Fragmenti DNA, nastali cijepanjem restrikcijskim enzimima, međusobno se mogu ligirati (pomoću T4 DNA-ligaze) ako:
⚫ fragmenti imaju ravne krajeve
⚫ fragmenti imaju kompatibilne (“ljepljive”) krajeve

Question 12

Što je rekombinacija?

Answer 12

Međusobno kombiniranje postojećih sljedova nukleotida

Question 13

Kako se čuvaju restrikcijski enzimi?

Answer 13

Čuvaju se na -20°C u glicerolu, a na sobnoj temperaturi uglavnom brzo gube aktivnost

Question 14

Religacija?

Answer 14

Ako imamo plazmid, i u taj plazmid želimo ubacit neki insert, to znači da taj plazmid
moramo pocijepat nekim restrikcijskim enzimom, linearizirani plazmid pomiješamo s insertom, ako
se plazmid zatvori sam sa sobom bez inserta kaže se da je došlo do religacije. Religacija uzrokuje
obnavljanje restrikcijskog mjesta

Question 15

Puferi za restrikcijske enzime?

Answer 15

nabavljaju se s odgovarajućim puferima (najčešće 10 puta koncentrirani)
⚫ pH, Mg2+, monovalentni kationi; reducens (stabilnost enzima)
* pH obično 7 do 9; Tris-HCl (10 mM)
* dvovalentni kation: MgCl2 (10 mM)
* monovalentni kation: NaCl ili KCl (0 - 150 mM)
* reducens: 2-merkaptoetanol ili ditiotreitol

Question 16

Optimalna temperatura restrikcijskih enzima?

Answer 16

najčešće 37°C (25-65°C), zapravo ovisi o optimalnoj temperaturi bakterije iz koje potječe enzim

Question 17

Kako udaljenost od kraja dsDNA utječe na aktivnost restrikcijskih enzima?

Answer 17

Neki enzimi ne mogu cijepati DNA u blizini krajeva dok kod nekih to nije bitno

Question 18

Kako definiramo jedinicu aktivnosti enzima?

Answer 18

jedna jedinica (“unit”, U) dovoljna je za potpuno cijepanje 1 μg DNA bakteriofaga lambda pri optimalnim uvjetima u volumenu od 50 μl, u periodu od jednog sata
⚫ 10, 20, 50, 100 . . . U/μL

Question 19

Kako se može spriječiti djelovanje restrikcijskih enzima?

Answer 19

inaktivacija restrikcijskog enzima
* 20-30 minuta na 60-70°C, samo ako su termolabilni (uglavnom jesu)
* dodatak EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina), helira Mg2+ - inaktivira i druge enzime (npr DNA-ligazu)
* sprječavanje kontakta DNA i enzima – fizičkim razdvjanjem DNA i enzima
* ekstrakcija s fenol/kloroform/izoamilni alkohol
* elektroforeza i izolacija DNA iz gela (vježbe)
* taloženje DNA (vježbe)

Question 20

Kako znamo koliko fragemenata DNA je nastalo restrikcijom i koliko su oni dugački?

Answer 20

Elektroforeza! Omogućava razdvajanje i vizualizacija fragmenata DNA