3. Elektroforeza nukleinskih kiselina Flashcards
Što elektroforeza omogućava?
Razdvajanje i vizualizaciju fragmenata DNA te izolaciju željenog fragmenta
Što je elektroforeza?
Metoda razdvajanja koja se zasniva na različitoj pokretljivosti nabijenih čestica u električnom polju.
Provodi se u odgovarajućem puferu koji služi kao elektrolit.
Razdvajanje molekula u električnom polju na temelju fizikalno kemijskih svojstava (naboj, veličina…)
Prema kojem polu migriraju nukleinske kiseline i zašto?
Prema pozitivnom polu zbog negativno nabijenih fosfatnih skupina.
Koje nosače razlikujemo?
Agarozni i poliakrilamidni gel.
O čemu ovisi brzina migracije molekula?
- veličini molekule (fragmenta) - manje molekule migriraju brže jer lakše prolaze kroz pore nosača
- konformaciji molekule (!!!) - jednolančane i dvolančana molekule; specifične strukture, dvolančana DNA - linearna, kružna, superzavijena
- koncentraciji nosača
- veća koncentracija – manji promjer pora – sporija migracija
- migriracija je sporija što je koncentaracija nosača veća
- naponu
- migracija je brža pri većem naponu
- previsoki napon – zagrijavanje i lošije razdvajanje
- uobičajeno 2 do 10 V/cm
- sekvencioniranje (denaturirajuća poliakrilamidna elektroforeza)
1700 V (400 V/cm) - puferu (elektrolit) – pH=8
- fosfatni, boratni, acetatni
Sve o agaroznom gelu.
izolira se iz morskih algi (rodovi Gelidium i Gracilaria)
pročišćavanjem se uklanjaju drugi šećeri, proteini, soli . . .
prosječna duljina lanaca – oko 800 monomera galaktoze
za elektroforezu se koristi jako pročišćena agaroza
postoji više tipova agaroze za posebne namjene (kemijski modificirane)
⚫ agaroza niskog tališta (“low melting point”) – talište sniženo na oko 65°C
koncentaracija agaroze u gelu
⚫ 0,5 do 2% (do 5%)
razdvajanje fragmenata
⚫ 100 pb do 25 kb
promjer pora u 1 %-tnoj agarozi
⚫ iznosi približno 150 nm
Sve o poliakrilamidnom gelu.
nastaje polimerizacijom akrilamida
koncentracija akrilamida – 3,5 do 20% (puno veće konc nego kod agaroze)
razdvajanje molekula kraćih od 2000 nukleotida
elektroforeza DNA se često provodi u denaturirajućim uvjetima (elektroforeza jednolančanih molekula)
koristi se i za razdvajanje molekula čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid
- omogućuje sekvencioniranje DNA
na migraciju dvolančanih molekula nukleinskih kiselina utječe i primarna
struktura
akrilamid je toksičan!
Usporedba agarozna i poliagrilamidne elektroforeze.
agarozna
priprema nosača - jednostavnija (jednostavni kalupi)
uređaji - jednostavniji (najčešće horizontalni)
koncentracija nosača (%) - 0,5-2 (5)
veličina molekula koje se razdvajaju elektroforezom - 100-25000 pb
akrilamidna
priprema nosača - kompliciranija, između dva stakla (akrilamid
je toksičan)
uređaji - kompliciraniji (najčešće vertikalni, kapilarni)
koncentracija nosača (%) - 3,5-20
veličina molekula koje se razdvajaju elektroforezom - kraće od 2000 nt
Kako se odabire koncentracija nosača?
Prema očekivanoj veličini fragmenata - manji fragmenti veća koncentracija nosača
Za što nam služi migracijsko bojilo (boja za nanošenje uzoraka) te od čega se sastoji?
specifično je teže od vode (zbog saharoze, glicerola ili fikola) pa upada u jažice i istisne pufer iz jažice i dobijemo
uzorak, bitno da je obojano jer vidimo šta radimo. U njemu se nalaze dvije boje. Svjetlo plava (xylene cyanol) boja u standardnim uvjetima elektroforeze putuje kao DNA duljine 5000pb, a ljubičasta (bromfenol plavo) putuje kao DNA
duljine 500pb. Razmak između boja će se povećavat zbog razlike u brzini putovanja boja. S ovime ne vizualiziramo DNA, nego otprilike znamo di će se fragmenti određene duljine nalaziti. Također sadrži Tris-HCl i EDTA radi stabilnosti.
Kako možemo vizualizirati DNA nakon elektroforeze?
gel, nakon elektroforeze, inkubirati u otopini etidij-bromida (1 μg/ml) 15-20 minuta (može se dodati u gel ili pufer prije elektroforeze)
* interkalira u DNA, apsorbira UV svjetlo i emitira svjetlo valne duljine 590
nm (narančasto-crveno)
* etidij-bromd je mutagen
* druge boje (SYBR Gold; SYBER Green I; Syber Green II)
Može li se elektroforeza koristiti za određivanje duljine fragmenata DNA?
može se koristiti za određivanje (procjenu) duljine fragmenata DNA ali samo ako je DNA linearizirana
ne može se koristiti za određivanje duljine cirkularnih (kružnih) molekula DNA (PLAZMIDI) ! ! !
zato što konformacija DNA utječe na brzinu migracije molekule kroz nosač, a kružne DNA/plazidi izolirani iz bakterija imaju superzavoje - superzavijena DNA je više kompaktna te brže migrira kroz nosač
Što znače oznake OC, SC i CCC.
otvoreni krug = open circle = OC
super uvijeni krug = „supercoil” = SC
kovalentno zatvoren krug = covalently closed circle = CCC
Kada na gel stavimo kružnu DNA vidimo li samo 1 vrpcu?
Kad na gel stavimo kružni plazmid dobijemo više vrpci, što je plazmid manji dobijemo više vrpci jer su različite konformacije zapravo stabilnije.
Plazmid izoliran z bakterije ima konformaciju superzavojnice no tijekom izolacije i pročišćavanja mogu nastati jednolančani i dvolančani lomovi -> različite konformacije koje različito migriraju u gelu
Koja konformacija DNA najbrže a koja najsporije migrira?
obično najbrže migrira superzavojnica, a
najsporije otvoreni krug (relaksirana DNA)
