1. Uvod u GI

Question 1

Što je genetičko inženjerstvo/tehnologija rekombinantne DNA?

Answer 1

Skup metoda koje omogućavaju uvođenje preciznih (ciljanih, točno određenih) genetičkih promjena u živoj stanici/organizmu
in vitro manipulacija genima

Question 2

Što je rekombinantna DNA? Možemo li ju označavati rDNA?

Answer 2

DNA koja se sastoji od dva ili više različitih fragmenata DNA, a nastaje kombiniranjem (prespajanjem) različitih molekula DNA koje mogu potjecati iz samo jednog, ali i iz dva ili više različitih izvora/organizma.
Ne možemo ju označavati rDNA jer rDNA označava ribosomalnu DNA.

Question 3

Kako razlikujemo genetičke modifikacije i mutacije?

Answer 3

Genetička promjena uvedena metodama genetičkog inženjerstva je genetička modifikacija. Genetička promjena nastala spontano ili djelovanjem mutagenog sredstva je mutacija.

Question 4

Primjena GI?

Answer 4

Znanstvena istraživanja npr. inaktivacija i modifikacija pojedinih gena (konstrukcija novih alela).
Primjena istraživanja- oplemenjivanje proizvodnih organizama, proizvodnja lijekova, enzima koji se koriste u proizvodnji hrane…obrada otpadnih voda

Question 5

Dogma molekularne genetike?

Answer 5

Međudjelovanje i prijenos informacije između informacijskih makromolekula (DNA, RNA i proteina)

Question 6

Klasično oplemenjivanje?

Answer 6

križanje selekcija, križanje selekcija….
dugotrajno i neprecizno
nasumična mutageneza
promjena ostalih svojstava?

Question 7

oplemenjivanje metodama GI

Answer 7

preciznije
dugotrajna i skupa komercijalizacija

Question 8

Postupci i tehnike u GI UKRATKO.

Answer 8

izolacija ili sinteza dijela (fragmenta) DNA od interesa
in vitro modifikacija (promjena redosljeda nukleotida) DNA
unošenje modificirane DNA u živi organizam
genetički modificirani organizam (GMO)

Question 9

Kako možemo dobiti DNA od interesa koja najčešće sadrži neki gen?

Answer 9

Reverznom transkripcijom iz mRNA-cDNA
fragmentiranjem genomske DNA
umnažanjem dijela genoma - PCR (lančana reakcija polimerazom)
kemijskom sintezom DNA

Question 10

Postupci i tehnike u GI DETALJNO

Answer 10

Imamo DNA od interesa (koju možemo dobiti na više načina) - INSERT
Insert ugrađujemo u odgovarajući VEKTOR (plazmid, bakteriofag)
Provodimo transformaciju/infekciju bakterije E.Coli
Provodimo selekciju/odabir kolonije koja sadrži željeni plazmid (vektor+insert)
Uzgoj odabrane bakterije/kolonije/klona s ciljem umnažanja i izolacije plazmida
Modifikacija, transformacija, selekcija, analiza (ovo se često ponavlja više puta) klonirane DNA
Transformacija organizma kojeg želimo modificirat = željeni GMO (neophodna detaljna analiza)

Question 11

Što je restrikcijsko mjesto?

Answer 11

Mjesto u kojem se pomoću enzima (restrikcijskih endonukleaza) plazmid/vektor može pocijepati čime dobimo linearnu DNA.
Mjesto na kojem djeluju restrikcijske endonukleaze u DNA.
Kratka sekvenca (najčešće 6pb) koju prepoznaju restrikcijski enzimi koji uvode
dvolančani lom, reže DNA i na taj način se plazmid linearizira.

Question 12

Primjer postupka i tehnika GI na E.Coli (slika), objasni što se sve dešava.

Question 13

Zašto su kolonije koje
sadrže plazmid sa insertom
uobičajene boje, a kolonije
koje sadrže plazmid bez
inserta plave boje?

Answer 13

Plazmid koji se koristi kao vektor sadrži gen lacZ, koji kodira enzim beta-galaktozidazu. Ovaj enzim može koristiti laktozu, ali i X-Gal kao supstrat. Hidrolizom X-Gala, beta-galaktozidaza proizvodi 5-bromo-4-kloro-indoksil, koji dimerizacijom formira plavi pigment. Restrikcijski enzim cijepa plazmid na određenom restrikcijskom mjestu, koje se nalazi unutar gena lacZ. Kada se plazmidi, inserti i DNA ligaza pomiješaju, dolazi do umetanja (insercije) DNA od interesa na restrikcijsko mjesto, čime se gen lacZ inaktivira i više ne proizvodi funkcionalni enzim beta-galaktozidazu.

Budući da nema funkcionalnog enzima, X-Gal se ne hidrolizira, pa se ne stvara plavi pigment. Kolonije koje sadrže vektor s umetnutim insertom stoga su bijele jer je gen lacZ inaktivan. S druge strane, kolonije koje sadrže samo vektor bez inserta imaju aktivan lacZ gen koji proizvodi beta-galaktozidazu, što rezultira hidrolizom X-Gala i stvaranjem plavog pigmenta.

Question 14

U kakvim organizmima se može eksprimirati modificirana DNA i kako se naziva taj organizam i ekspresija?

Answer 14

DNA se može eksprimirati u organizmu koji je različit od onog iz kojeg je DNA izolirana
* transgen; transgeni organizam
* heterologna ekspresija
DNA se može eksprimirati u organizmu iz kojeg ta DNA potječe
* cisgen; cisgeni organizam
* homologna ekspresija

Question 15

Na koje probleme nailazimo pri ekspresiji humanih proteina u bakteriji E.Coli? Kako ih možemo riješiti?

Answer 15

*introni, sekvencije slične terminatorima, pristrana uporaba sinonimnih kodona
(“codon bias”)
* posttranslacijske modifikacije (proteoliza, glikozilacija, disulfidne veze), pravilna
trodimenzionalna struktura proteina, degradacija proteina

• ekspresija cDNA, prilagođavanje upotrebe kodona
• koriste se ekspresijski plazmidi koji sadrže bakterijski promotor, sekvenciju “Shine-Dalgarno” i terminator – klonira se samo ORF

Question 16

Primjeri uspješne proizvodnje humanih proteina u bakteriji E.coli u najranijim
godinama primjene GI?

Answer 16

• somatostatin (1977)
• inzulin (1978)
• somatotropin (1979)

Question 17

Somatostatin

Answer 17

-hormon koji sudjeluje u regulaciji lučenja hormona rasta i u regulaciji probavnog sustava
-peptid dugačak 14 ak, poznat redoslijed
-DNA je kemijski sintetizirana, fuzionirana s genom lacZ (beta-galaktozidaza) u okviru čitanja i pod regulacijom promotora lac (fuzijski gen) -> translacijom nastaje fuzijski protein
-fuzijski protein cijepan cijanogen-bromidom točno na mjestu između beta-galaktozidaze i somatostatina ->izolacija i pročišćavanje somatostatina

Question 18

Zašto je ORF za
somatostatin fuzioniran s
genom lacZ?

Answer 18

ORF za somatostatin fuzioniran je s genom lacZ kako bi se omogućila stabilna i učinkovita ekspresija somatostatina u bakterijama. Fuzija s većim proteinom, poput β-galaktozidaze, štiti somatostatin od razgradnje, jer je sam po sebi mali i nestabilan peptid. Također, lacZ gen omogućava detekciju transformiranih bakterija pomoću blue-white screening metode (pri kojoj plave kolonije ukazuju na prisutnost funkcionalnog lacZ gena, dok bijele označavaju prisutnost inserta). Ekspresija je pod kontrolom jakog lac promotora, što osigurava visoku razinu proizvodnje proteina. Nakon pročišćavanja tog proteina, somatostatin se može odvojiti enzimskom obradom kako bi se dobio čist peptid.

Question 19

Inzulin

Answer 19

-hormon koji regulira razinu glukoze u krvi, a luči ga gušterača
-sastoji se od dva polipeptidna lanca - A lanac od 21 ak i B lanac od 30 ak
- slična strategija kao i za somatostatin
dva plazmida (jedan sadrži sekvenciju za A-, a drugi B-lanac)
zasebna ekspresija i izolacija A- i B-lanca
odvajanje β-galaktozidaze (BrCN)
izolacija i pročišćavanje
disulfidni mostovi između A- i B-lanaca

Question 20

Somatotropin

Answer 20

-hormon rasta
-191 aminokiselina
-cDNA (kodirajuća DNA) sintetizirana pomoću reverzne transkriptaze na temelju mRNA izolirane iz hipofize
-ekspresija fuzijskog proteina

Question 21

Humani faktor VIII

Answer 21

-neophodan za grušanje krvi, nemogućnost sinteze – hemofilija
-Problemi pri dobivanju iz E.coli
gen: 186 kb, 25 introna
mRNA kodira za polipeptid od 2351 ak koji se posttranslacijski modificira - dva glikozilirana polipeptidna lanca koji sadrže 17 disulfidnih veza

-cjelokupna cDNA klonirana u stanicama hrčka u kulturi – jako slabi prinos

-cDNA jednog i drugog polipeptida zasebno eksprimirana u stanicama hrčka
Ag promotor (kokošji β-aktin i zečji β-globin); signal za poliadenilaciju iz virusa SV40
Prinos povećan za više od 10 puta

-cjelokupna cDNA stavljena pod regulaciju promotora za „protein sirutke” (“whey acidic protein”) i to u mliječnoj žlijezdi svinje

Question 22

Što je pharming?

Answer 22

Korištenje transgenih i cisgenih biljaka i životinja za ekspresiju nekog transgena/cisgena u svrhu izolacije željenog proizvoda (farmacija, medicina, veterina…)

Question 23

Što je transgen?

Answer 23

Gen iz nekog drugog organizma (ljudski gen u bakteriji, bakterijski gen u biljci…)

Question 24

Što je transgeni organizam?

Answer 24

transgeni organizam (GMO) – organizam koji u svim stanicama sadrži transgen

Question 25

Neka otkrića koja su bitno utjecala na utjecaj i razvoj GI?

Answer 25

1970 – izolacija i upotreba restrikcijskih endonukleaza (otkrivene 1952)
1972 – „in vitro rekombinacija” fragmenata DNA (restrikcijski enzimi i DNA-ligaze)
1973 – elektroforeza DNA u agaroznom gelu
1973 – umnažanje prvog rekombinantnog plazmida u bakteriji
1977 – sekvencioniranje DNA - - - - - - - - - bioinformatika (genomika, proteomika, . . .)
1977 – sekvencioniranje DNA - - - - - - - - - bioinformatika (genomika, proteomika, . . .)
1981 – patentiran prvi transgeni (rekombinantni) organizam – oil-eating bacterium
1981 – konstruiran prvi transgeni sisavac (miš)
1983-1985 – lančana reakcija polimerazom (“polymerase chain reaction”) – PCR
1986 – transgene (GM) biljke postaju komercijalno dostupne
1990 – prva genska terapija na čovjeku
1990 – početak “Human Genome Project” (sekvencioniranje ljudskog genoma)