5- Thérapies géniques pour les maladies neurodégénératives et neuromusculaires

Question 1

Que veut dire l’acronyme CRISPR?

Answer 1

Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats

Question 2

Quelles sont les 3 grandes étapes du fonctionnement de la machinerie CRISPR-Cas9?

Answer 2

1. ARNg trouve et se lie à la séquence d’ADN auquel il est complémentaire
2. Cas9 couple les 2 brins d’ADN
3. La cellule reconnait que l’ADN est endommagé et essaye de réparer

Question 3

Quel est le PAM de la Cas9 de la bactérie streptocoque pyogènes?

Answer 3

NGG

Question 4

Qu’est-ce qui explique le fait que la cellule va réparer majoritairement avec le non-homologous end joining (NHEJ) et non le homologous direct repair (HDR)?

Answer 4

Avec le HDR on doit fournir un gabarit à la cellule pour la réparation alors que NHEJ non

Question 5

Comment fonctionne la méthode Guide-Seq?

Answer 5

Induction d’une cassure double-brin avec une cas9. Dans cette coupure, nous insérons un oligonucléotide phosphoré agissant comme une étiquette ce qui permet de séquencer précisément cette région

Question 6

À quoi sert majoritairement la méthode de Guide-Seq?

Answer 6

Détecter les événements d’édition du génome qui sont off-target sans devoir séquencer tout le génome

Question 7

Quels sont les avantages d’avoir différentes Cas9?

Answer 7

Elles reconnaissent différent PAM donc peuvent couper différents endroits du génome

Question 8

Nommer l’avantage de saCas9

Answer 8

+ petite donc + facile à insèrer dans les virus adéno-associés

Question 9

Quelle est la réaction chimique lorsque l’on change une cytosine pour une thymine?

Answer 9

déamination

Question 10

Nommer le désavantage/la limitation de l’utilisation du base editing?

Answer 10

l’édition se fait pour toutes les bases cibles qui sont à une distance appropriée du PAM

Question 11

vrai ou faux: le prime editing permet de changer n’importe quel nucléotide dans le génome humain par un autre

Answer 11

vrai

Question 12

De quoi est formée la machinerie du prime editing ?

Answer 12

spCas9 nickase + Reverse transcriptase + pegRNA

Question 13

Quelles sont les 3 régions importantes de pegRNA?

Answer 13

• PBS: primer binding site, se lie au brin coupé qui doit être corrigé
• RTT: reverse transcriptase template, c’est le gabarit pour la reverse transcriptase
  Spacer: reconnait 20 nos dans le génome

Question 14

Quelle est la limitation du prime editing?

Answer 14

La modification des nts peut être perdu en raison de la résolution du “Flap”

Question 15

Quelles sont les méthodes pour améliorer le prime editing?

Answer 15

• Répéter le traitement
• Ajouter une cassure supplémentaire
• Muter le PAM après l’avoir reconnu
• Insérer une mutation additionnelle (silencieuse ou non)
• Optimiser la longueur du RTT et PBS
• Utiliser un engineered pegRNA
• Utiliser Pemax
• Utiliser le bon type de cellules

Question 16

De quoi est formé le PE3 ?

Answer 16

(PE2+Cas9)+(sgRNA+Cas9)

Question 17

Comment est-ce que le PE3 ajoute-t-il une cassure supplémentaire?

Answer 17

Le sgRNA couplé à sa Cas9 reconnait le brin qui est non-corrigé et induit une coupure

Question 18

Comment est-ce que l’utilisation du PE3 peut-il améliorer le prime editing ?

Answer 18

La coupure du brin non-corrigé pousse la cellule à utiliser le flap 3’ contenant la mutation corrigée pour résoudre le problème des 2 flaps

Question 19

Comment est-ce que la mutation du PAM peut-elle améliorer le prime editing?

Answer 19

En induisant une mutation dans PAM lors de la correction de la mutation voulue, la machinerie Cas9 ne pourra pas se relier au brin et le re-éditer

Question 20

Comment est-ce que l’utilisation d’un epegRNA améliore le prime editing?

Answer 20

Le epegRNA contient un pseudoknot ce qui prévient sa dégradation par les exonucléases de la cellule

Question 21

Quelle est la différence entre le PE3 et le PEmax?

Answer 21

PEmax contient 2 mutations additionnelles pour prévenir son inhibition par des protéines MMR et contient des codons RT humanisé ce qui augmente son expression dans les cellules humaines

Question 22

Quelles sont les 6 méthodes de livraison?

Answer 22

• Plasmides
• AAV
• LNP
• EV
• VLP
• Chitosan nanoparticules

Question 23

Quelle est la limitation de l’utilisation des AAV?

Answer 23

Pour livrer la machinerie du prime editing ; 2 AAV doivent être utilisés ce qui diminue l’efficacité de l’édition