Κεφάλαιο 4: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Question 1

Τι είναι το ανασυνδυασμένο DNA;

Answer 1

Είναι μόριο DNA, το οποίο δημιουργείται in vitro (σε δοκιμαστικό σωλήνα) και περιέχει γονίδια DNA από 2 ή περισσότερους οργανισμούς.

Question 2

Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ποιος είναι ο ρόλος τους;

Answer 2

ΟΙ περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα τα οποία παράγονται σε βακτήρια.
Ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι η προστασία του βακτηρίου από την εισβολή “ξένου” DNA (πχ των φάγων).
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA και “κόβουν σε καθορισμένα σημεία. Συνήθως, οι αλληλουχίες αναγνώρισης των περιοριστικών ενδονουκλεασών είναι παλινδρομικές αλληλουχίες, δηλαδή οι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες αλληλουχίες “διαβάζονται” το ίδιο από 5’–>3’.

Question 3

Τι είναι η γενετική μηχανική και πως βοηθάει τον άνθρωπο;

Answer 3

Είναι το σύνολο των διαφορετικών τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος παρεμβαίνει στο γενετικό υλικό των οργανισμών. Με την βοήθεια της Γενετικής Μηχανικής, επιτεύχθηκαν οι στόχοι:
1. κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στην Γη
2. βελτίωση της υγείας και των τρόπων διαβίωσης των ανθρώπων με εφαρμογές στην Ιατρική, της γεωργία και την κτηνοτροφία.

Question 4

Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης;

Answer 4

Είναι μόρια DNA, τα οποία μπορούν να αντιγράφονται ανεξάρτητα από το DNA του κυττάρου-ξενιστή. Τα πλασμίδια είναι πιο απλά και ευρέως χρησιμοποιημένα, ενώ το DNA των φάγων έχει πιο πολύπλοκη διαδικασία.

Question 5

Τι είναι κλωνοποίηση και τι είναι οι κλώνοι;

Answer 5

Κλωνοποίηση ονομάζεται η δημιουργία συνήθως μεγάλου αριθμού αντιγράφων, πανομοιότυπων μορίων κυττάρων ή οργανισμών. Κλώνος ονομάζεται το σύνολο των πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.

Question 6

Τι είναι το κύτταρο-ξενιστής;

Answer 6

Κύτταρο-ξενιστής ονομάζεται το κύτταρο το οποίο θα “δεχθεί’ την ποσότητα DNA την οποία επιθυμούμε να αντιγράψουμε εκατομμύρια φορές (πχ τα βακτήρια)

Question 7

Γιατί τα πλασμίδια είναι άριστοι φορείς κλωνοποίησης;

Answer 7

Τα πλασμίδια είναι εξαιρετικοί φορείς κλωνοποίησης, επειδή:
1. διαθέτουν διάφορες ειδικές αλληλουχίες αναγνώρισης για διάφορες περιοριστικές ενδονουκλεάσες
2. Εισάγονται εύκολα σε κύτταρο-ξενιστή
3. Αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή
4. Διαθέτουν γονίδια ανθεκτικότητας σε διάφορα αντιβιοτικά, που βοηθούν στην διάκριση των μετασχηματισμένων βακτηρίων από τα μη-μετασχηματισμένα βακτήρια
5. Η διαδικασία κλωνοποίησης στα βακτήρια είναι σχετικά απλή, γι’ αυτό χρησιμοποιούνται πολύ συχνά ως φορέας κλωνοποίησης για οργανισμούς με μικρο γονιδίωμα

Question 8

Ποια είναι τα στάδια δημιουργίας μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης;

Answer 8

1. Απομόνωση του γονιδιώματος από ένα κύτταρο-δότη με την χρήση υποτονικού διαλύματος
2. Χρήση μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης για την δημιουργία θραυσμάτων του γονιδιώματος
3. Απομόνωση πλασμιδίου το οποίο χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης (χρήση της ίδιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης ή ενδονουκλεάσης που δημιουργεί κοινά μονόκλωνα άκρα)
4. Ανάμειξη των 2 DNA και προσθήκη DNA δεσμάσης για την δημιουργία φωσφοδιεστερικών δεσμών.
5. Μετασχηματισμός
6. Διάκριση των μετασχηματισμένων βακτηρίων από εκείνα που δεν έχουν δεχθεί πλασμίδιο με την βοήθεια αντιβιοτικού.
   7.Χρήση ιχνηθετημένων ανιχνευτών για τον εντοπισμό του βακτηριακού κλώνου που περιέχει την επιθυμητή προς μελέτη αλληλουχία.

Question 9

Τι είναι ο μετασχηματισμός;

Answer 9

Μετασχηματισμός είναι η είσοδος DNA (ανασυνδυασμένου ή μη) σε ένα βακτήριο-ξενιστή.

Question 10

Πώς γίνεται ο μετασχηματισμός των βακτηρίων;

Answer 10

Τα τοιχώματα των βακτηρίων με κατάλληλες χημικές ουσίες γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια και έτσι επιτρέπεται η είσοδος τω πλασμιδίων.

Question 11

Πόσες κατηγορίες βακτηρίων προκύπτουν μετά τον μετασχηματισμό και ποιες είναι αυτές;

Answer 11

Μετά τον μετασχηματισμό θα υπάρχουν 3 κατηγορίες βακτηρίων:
1. Μη-μετασχηματισμένα βακτήρια
2. Μετασχηματισμένα βακτήρια με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο
3. Μετασχηματισμένα βακτήρια με μη-ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

Question 12

Πώς μπορούμε με την βοήθεια αντιβιοτικού να διακρίνουμε τα μετασχηματισμένα από τα μη-μετασχηματισμένα βακτήρια;

Answer 12

Με την χρήση του αντιβιοτικού, όσα βακτήρια δεν έχουν δεχθεί το πλασμίδιο θα είναι ευαίσθητα στο αντιβιοτικό, ενώ όσα έχουν δεχθεί πλασμίδιο θα είναι ανθεκτικά σε αυτό.

Question 13

Τι ονομάζεται ιχνηθέτηση;

Answer 13

Η σήμανση χημικών μορίων με την βοήθεια ραδιενεργών ισοτόπων, φθοριζουσών ουσιών κ.α.

Question 14

Τι ονομάζεται Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη και τι περιέχει;

Answer 14

Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν το συνολικό DNA ενός οργανισμού-δότη. Μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχειχιλιάδες κλωνοποιημένα κομμάτια χρωμοσωμικού DNAτα οποία έχουν προέλθει από την δράση μαι περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Τα κομμάτια αυτά μπορούν να περιέχουν:
1. ολόκληρα γονίδια
2. τμήματα γονιδίων
3. περιοχές που δεν αποτελούν γονίδια

Question 15

Τι σημαίνει αποδιάταξη;

Answer 15

Αποδιάταξη είναι ο αποχωρισμός 2 συμπληρωματικών αλυσιδών in vitro (σπάνε δηλαδή οι δεσμοί υδρογόνου) είτε με κατάλληλες χημικές ουσίες είτε με αύξηση της θερμοκρασίας

Question 16

Τι σημαίνει υβριδοποίηση;

Answer 16

Υβριδοποίηση ονομάζεται η σύνδεση (δημιουργία δηλαδή δεσμών υδρογόνου) 2 αλυσίδων DNA ή DNA RNA λόγω συμπληρωματικότητας σε κατάλληλες συνθήκες.

Question 17

Τι είναι οι ανιχνευτές;

Answer 17

Οι ανιχνευτές είναι ιχνηθετημένα μόρια DNA ή RNA συμπληρωματικά και αντιπαράλληλα προς την επιθυμητή αλληλουχία.

Question 18

Ποιες είναι οι προϋποθέσεις που πρέπει να έχει ένα πλασμίδιο για να είναι κατάλληλος φορέας κλωνοποίησης;

Answer 18

1. Να φέρει μία Θέση Έναρξης Αντιγραφής (Θ.Ε.Α.), δηλαδή να μπορεί να αντιγράφεται ανεξάρτητα
2. Να φέρει μια αλληλουχία αναγνώρισης της εκάστοτε χρησιμοποιούμενης περιοριστικής ενδονουκλεάσης
   3.Να φέρει τουλάχιστον 1 γονίδιο ανθετικότητας σε αντιβιοτικά
3. Να μπορεί να δεχθεί ποσότητα DNA (μέγεθος του πλασμιδίου)

Question 19

Ποιες είναι οι προϋποθέσεις που πρέπει να έχει ένα βακτήριο για να είναι κατάλληλο κύτταρο-ξενιστής;

Answer 19

1. Να έχει ανενεργά ή μεταλλαγμένα τα γονίδια των περιοριστικών ενδονουκλεασών, ώστε τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που θα εισαχθούν να μην καταστραφούν.
2. Να μην φέρει ως επί το πλείστον γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά
3. Να μπορεί να μετασχηματιστεί.

Question 20

Ποιος είναι ο σκοπός των DNA βιβλιοθηκών;

Answer 20

Σκοπός τους είναι η παραγωγή πολλών αντιγράφων (κλώνων) μιας αλληλουχίας DNA, ώστε να την μελετήσουμε και να εκφράσουμε την πληροφορία που αυτή φέρει.

Question 21

Γιατί τα βακτήρια χαρακτηρίζονται ως εργοστάσια παραγωγής ανθρώπινων πρωτεϊνών;

Answer 21

1. Οι διαδικασίε μεταγραφής και μετάφρασης είναι κοινές σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς
2. Ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν καθολικός
3. Τα ριβοσώματα αποτελούν θέση μετάφρασης οποιουδήποτε mRNA

Question 22

Σε πόσες κατηγορίες διακρίνονται τα γονίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών που μεταγράφονται σε mRNA;

Answer 22

α) Σε συνεχή γονίδια (απουσία εσωνίων) –> υπό προϋποθέσεις μπορεί να γίνει η σωστή έκφραση του γονιδίου και να παραχθεί φυσιολογικό λειτουργικό πεπτίδιο.
__________________________________________
β) Σε ασυνεχή γονίδια (παρουσία εσωνίων) –> αποκλείεται η σωστή έκφρασή του διότι μετά την μεταγραφή δεν είναι δυνατή η ωρίμασνή του

Question 23

Ποιες προϋποθέσεις πρέπει να πληρεί ένα ευκαρυωτικό γονίδιο για να εκφραστεί σε ένα βακτήριο;

Answer 23

1. Πρέπει να εισαχθεί στο πλασμίδιο χωρίς τον υποκινητή του, επειδή οι προκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν μικρότερο αριθμό μεταγραφικών παραγόντων από τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και δεν μπορούν να προσδεθούν στον υποκινητή ενός ευκαρυωτικού γονιδίου.
2. Το γονίδιο που θα εισαχθεί χωρίς τον υποκινητή του στο πλασμίδιο πρέπει να συνδεθεί με τον κατάλληλο προσανατολισμό (5’ άκρο κωδικής στον υποκινητή και 3’ άκρο μη-κωδικής μακριά από αυτόν)
3. Το γονίδιο που θα εισαχθεί θα πρέπει να προσδεθεί στην σωστή πλευρά του υποκινητή.

Question 24

Πώς γίνεται η έκφραση ασυνεχών γονιδίων σε βακτήρια-ξενιστές;

Answer 24

1. Απομόνωση ολικού ώριμου mRNA από τον κυτταρικό τύπο.
2. Χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης για την σύνθεση ενός υβριδικού μορίου mRNA-cDNA.
3. Αποδιάταξη ή καταστροφή του mRNA με κατάλληλες χημικές ουσίες ή υψηλή θερμοκρασία
4. Μονόκλωνο cDNA –> δίκλωνο cDNA (DNA πολυμεράση)
5. Εισαγωγή δίκλωνου DNA σε φορέα κλωνοποίησης.
6. Δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης με τηνβοήθεια ειδικών μορίων ανιχνευτών.

Question 25

Τι είναι μια cDNA βιβλιοθήκη;

Answer 25

Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν αντίγραφα των γονιδίων που μεταγράφονται με mRNA ενός κυτταρικού τύπου με το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των εξωνίων.

Question 26

Ποια αλυσίδα του γονιδίου αποτελεί η cDNA αλυσίδα;

Answer 26

Αποτελεί την μη-κωδική αλυσίδα του γονιδίου, χωρίς τα εσώνια.

Question 27

Ποια ένζυμα χρησιμοποιούνται για την κατασκευή μιας cDNA βιβλιοθήκης; (ονομαστικά)

Answer 27

1. Αντίστροφη μεταγραφάση
2. DNA πολυμεράση
3. περιοριστική ενδονουκλεάση
4. DNA δεσμάση

Question 28

Ποιες αλληλουχίες ΔΕΝ ΥΠΆΡΧΟΥΝ σε μια cDNA βιβλιοθήκη;

Answer 28

1. εσώνια
2. υποκινητές
3. περιοχές που δεν αποτελούν γονίδια
4. αλληλουχίες λήξης μεταγραφής **
5. γονίδια που μεταγράφονται και παράγουν tRNA, rRNA, snRNA
6. γονίδια που δεν εκφράζονται στον συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο ή αναπτυξιακό στάδιο, λόγω κυτταρικής διαφοροποίησης

Question 29

Ποιες αλληλουχίες ΥΠΆΡΧΟΥΝ σε μια cDNA βιβλιοθήκη;

Answer 29

1. εξώνια των γονιδίων που εκφράζονται στον συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο
2. οι 5’ και 3’ αμετάφραστες περιοχές

Question 30

Ποιος είναι ο σκοπός μιας cDNA βιβλιοθήκης;

Answer 30

Η έκφραση ενός ασυνεχούς γονιδίου σε ένα βακτήριο-ξενιστή, χρησμοποιώντας το ώριμο mRNA)

Question 31

Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και σε ποιους τομείς εφαρμόζεται;

Answer 31

Είναι τεχνική η οποία μας επιτρέπει να αντιγράψουμε εκατομμύρια φορές ειδικές αλληλουχίες DNA μέσα από σύνθετο μείγμα μορίων DNΑ in vitro.
Έχει πρακτεικές εφαρμογές:
1. στην ιατρική (ανίχνευση γενετικών ασθενειών)
2. στην εγκληματολογία (διαλεύκανση υποθέσεων)
3. στην μελέτη DNA απολιθωμάτων

Question 32

Τι απαιτείται για να ξεκινήσει η PCR;

Answer 32

Χρειάζονται ειδικές αλλληλουχίες DNA συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες στο 3’ άκρο της κάθε αλυσίδας του τμήματος DNA που θα υποστεί κλωνοποίηση.

Question 33

Πόσοι μέθοδοι κλωνοποίησης υπάρχουν;

Answer 33

Υπάρχουν 3 μέθοδοι.
1. γονιδιωματική βιβλιοθήκη
2. cDNA βιβλιοθήκη
3. PCR