2.4 - priprava preparatov za elektronsko mikroskopijo

Question 1

Kakšna je priprava za elektronsko mikroskopijo?

Answer 1

1. FIKSACIJA: mora biti hitrejša in učinkovitejša kot za svetlobno mikroskopijo

• ali kemijska ali fizikalna fiksacija

Question 2

Kateri so osnovni kemijski fiksativi v elektronski mikroskopiji?

Answer 2

• gluteraldehid
• formaldehid
• OsO4

Question 3

Predstavi gluteraldehid.

Answer 3

• reagira z aminokislinami (lizin)
• (reagira z lipidi, ogljikovimi hidrati, nukleinskimi kislinami)
• rezultat: zamreženje celičnih sestavin
• slabost: počasi prodira v tkivo in celice

Question 4

Predstavi formaldehid.

Answer 4

• mešanica z gluteraldehidi
• hitreje prodre v tkivo
• slabost: stabilizira le začasno, reverzibilno

Question 5

Prestavi OsO4.

Answer 5

• sekundarni fiksativ
• reagira predvsem z lipidi
• oborina, ki prispeva h kontrastnosti

Question 6

Kateri način poznaš za fizikalno fiksacijo v elektronski mikroskopiji?
Kako se razlikuje od kemijskega?

Answer 6

• ultrahitro zamrzovanje = kriofiksacija
• poteka hitreje
• v celico ne dodamo tujih molekul

Question 7

Kako se pri fizikalni fiksaciji izognemo poškodovanju celičnih struktur?
Kako imenujemo ta postopek?

Answer 7

• pri počasnem zamrzovanju nastajajo kristali vode, ki lahko poškodujejo celične strukture
• majhne koščke tkiva se zato zmrzuje v tekočem dušiku/heliju
• nastane amorfni led = VITRIFIKACIJA

Question 8

Kakšne so prednosti vitrifikacije?

Answer 8

• celične strukture ostanejo nespremenjene
• ohrani se ultrastruktura celic, podobna stanju in vivo

Question 9

Kakšni morajo biti preparati pri presevni elektronski mikroskopiji in zakaj?

Answer 9

• dobro fiksirani, suhi, tanki, kontrastni
• zaradi sipanja elektronov v vakuumu

Question 10

Kakšne rezine pripravljamo pri presevnem elektronskem mikroskopu?
Kakšen je osnovni pristop priprave teh rezin?

Answer 10

• ultratanke rezine

1. fiksacija
2. dehidracija
3. vklapljanje
4. rezanje
5. kontrastiranje

Question 11

Kako poteka fiksacija ultratankih rezin?

Answer 11

• primarna fiksacija: fiksiramo z gluteraldehidom, s formaldehidom ali z njuno mešanico
• spiranje s pufrom
• sekundarna fiksacija z OsO4

Question 12

Kako potekata dehidracija in vklop ultratankih rezin?

Answer 12

• dehidracija: z etanoli naraščajočih koncentracij
• vklop: v hidrofobno, umetno smolo (npr. epon), 60-80°C

Question 13

Kako se pri ultratankih rezinah izognemo, da bi izgubili del preparata, ki nas zanima?

Answer 13

• najprej pripravimo poltanke rezine, ki nam omogočajo orientacijo v preparatu s pomočjo svetlobnega mikroskopa

Question 14

Kako režemo ultratanke/poltanke rezine?

Answer 14

• z ultramikrotomom - steklen ali diamantni nož
• noži so opremljeni s kadičko z vodo
• rezine s kapljico vode poberemo na kovinsko mrežico
• debelina 1 mikrometer

Question 15

Kako barvamo poltanke rezine?

Answer 15

• barvamo jih s toluidinskim modrilom skupaj z umetno smolo
  (pri parafinskih rezinah ni skupaj s smolo!)

Question 16

Kako poteka kontrastiranje?

Answer 16

• ko se mrežica s preparatom posuši, kontrastiramo
• vnos atomov težjih kovin: kombinacija svinčevega citrata in uranilacetata

Question 17

Kaj je zamrzovalno lomjenje?

Answer 17

• priprava preparata za presevni mikroskop
• omogoča opazovanje celičnih membran in membranskih proteinov (integralni proteini v lipidnem dvosloju)

Question 18

Kakšen je postopek priprave zamrzovalnega lomljenja?

Answer 18

1. zamrzovanje
2. lomljenje
3. izdelava replike
4. čiščenje replike

Question 19

Kako fiksiramo tkivo pri zamrzovalnem lomljenju?
Kako lomimo tkivo?

Answer 19

• z ultrahitrim zamrzovanjem
• z ohlajenim kovinskim nožem
• visok vakuum in nizka temperatura
• nastane molekulski relief
• replika: poberemo jo s kovinsko mrežico

Question 20

Ali je debelina preparata omejujoč dejavnik pri vrstičnem mikroskopu? Zakaj?

Answer 20

• ne
• primarni elektroni potujejo po površini preparata, od točke do točke, NE PRESVETLIJO PREPARATA

Question 21

Katere so stopnje priprave preparatov za vrstični elektronski mikroskop?

Answer 21

1. kemijska fiksacija
2. dehidracija
3. sušenje
4. pritrditev vzorca na nosilec
5. napraševanje

• fiksacija in dehidracija sta podobni kot pri pripravi preparatov za presevno elektronsko mikroskopijo
• preparat očistimo v pufru

Question 22

Opiši postopek po dehidraciji, sušenje.
(vrstični mikroskop)

Answer 22

• po dehidraciji preparat prepojimo s tekočim CO2 in ga posušimo pri kritični točki CO2

Question 23

Kaj storimo s posušenimi vzorci preparatov za vrstični elektronski mikroskop?

Answer 23

• prilepimo jih na kovinske nosilce
• prekrijemo jih s prevodnim elementom, da povečamo signal
• preparatov NE KONTRASTIRAMO
  -> površina opazovanega vzorca je razgibana
  -> primarni elektroni jo zadevajo pod različnimi koti

Question 24

Kaj je tomografija?

Answer 24

• TEM
• objekt si ogledamo s čim več različnih položajev