2.2 - priprava preparatov za svetlobno mikroskopijo

Question 1

Katere preparate lahko opazujemo s svetlobnim mikroskopom?
Iz katerih celic jih pripravimo?

Answer 1

• sveže mikroskopske preparate

Pripravimo jih:
- iz celic, ki niso pritrjene na druge celice ali medceličnino, npr. spolne celice
- iz celic, pri katerih lahko povezavo preprosto prekinemo, npr. celice ustne sluznice
- iz tankih, prosojnih tkiv
- morajo biti v kapljici izotonične raztopine (0,9% NaCl)

Question 2

Kakšna je slika svežih mikroskopskih preparatov in kako jo izboljšamo?

Answer 2

• slika je slabo kontrastna

Kontrastnost povečamo, če
- opazujemo s faznokontrastnim mikroskopom
- preparate obarvamo z vitalnim barvanjem (vitalna barvila, npr. Janusovo zelenilo za aktivne mitohondrije)

Question 3

Kakšen mora biti trajni histološki preparat?

Answer 3

• obstojen, ustrezno tanek in kontrasten

Question 4

Zakaj je potrebna fiksacija pri pripravi trajnega histološkega preparata?

Kdaj se izvede?

Katere vrste poznaš?

Answer 4

1. FIKSACIJA:
   - prepreči morfološke in molekularne spremembe

• izvede se čim hitreje po odvzemu iz organizma
• preprečena sta avtoliza (samorazgradnja celic zaradi proteaz) in bakterjski razvoj celic
• ustavimo življenjske procese celice in ohranimo strukturo in vivo
• poznamo kemijsko in fizikalno fiksacijo

Question 5

Kako kemijsko fiksiramo.
Vrste kemijskih fiksativov.

Answer 5

• tkivo fiksiramo z molekulami, ki delujejo na proteine
• priprava PARAFINSKIH REZIN
• na kakovost fiksacije vplivajo tudi pH fiksativa (6-8), osmolarnost fiksativa, temperatura, trajanje fiksacije

Primeri:
- aldehidi - nastanek novih vezi znotraj proteinske molekule, zamrežijo proteine v citoplazmi
- alkoholi - denaturirajo proteine, fiksirajo ogljikove hidrate
- organske kisline - denaturirajo proteine
- oksidanti - OsO4, oksidirajo nenasičene maščobne kisline, membrane

Question 6

Opiši še 2 mešanici kemijskih fiksativov.

Answer 6

a) Carnoyev fiksativ - etanol, kloroform, ocetna kislina
b) Bouinov fiksativ - pikrinska kislina, formaldehid, ocetna kislina

Question 7

Kaj sledi fiksaciji kemijskih fiksativov?

Answer 7

• izpiranje fiksativa s fosfatnim pufrom (pH 7,4)
• postopna dehidracija z etanolom

Question 8

Kaj je bistrenje?

Kaj se zgodi po njem?

Answer 8

• tkivo iz absolutnega etanola prenesemo v ksilol, ki omogoči boljšo prepojitev tkiva s tekočim parafinom
• ker v ksilolu postane tkivo po videzu prosojno, temu rečemo bistrenje

Question 9

Kaj se zgodi po bistrenju?

Answer 9

1. iz ksilola prenesemo košček tkiva v tekoči parafin
2. pustimo ga v termostatu (57 - 60°C), da se tkivo popolnoma prepoji s parafinom
3. po ohladitvi na sobno temperaturo nastane PARAFINSKI BLOK, ki je pripravljen na rezanje

Question 10

Kako narežemo parafinske rezine?

Answer 10

• z mikrotomom
• debelina 3-10 mikrometrov
• prenesemo jih na površino tople vode (se raztegnejo=
• posušimo jih na zraku

Question 11

Kako poteka barvanje parafinskih rezin?

Answer 11

1. deparafiniranje - odstranjanje ksilola iz rezin z absolutnim etanolom
2. rehidracija rezin z etanoli

• barvamo za boljši kontrast
• afiniteta barvila: posledica privlačnih sil med nasprotno nabitimi ionskimi skupinami barvila in celičnih struktur
• barvanje s hematoksilinom in z eozinom

Question 12

Katera barvila za barvanje parafinskih rezin poznaš? Kaj obarvata?

Answer 12

a) HEMATOKSILIN:
- kationsko, bazično barvilo, ki privlači anionske skupine nukleinskih kislin
- obarva jedro modro-vijolično

b) EOZIN:
- anionsko, kislo barvilo, ki privlači kationske skupine proteinov citoplazme
- obarva citoplazmo rožnato

c) Azansko barvanje:
- barvili azokarmin in anilinsko modrilo
- citoplazma = rumena
- jedro = rdeče
- kolagenska vlakna = modro

d) Barvanje po Giemsu:
- barvanje kromosomov
- jedra celic/kromosome obarva modro-vijolično

e) Acetokarmin
- deluje kot fiksativ
- rdeče barvilo

Question 13

Kaj storimo po barvanju parafinskih rezin?

Answer 13

1. speremo jih z destilirano vodo
2. rezine dehidriramo v etanolih
3. rezine prenesemo v ksilol
4. rezine zalijemo s kapljico Kanadskega balzama ali sintetične smole ter jih pokrijemo s krovnikom

• Kanadski balzam in smola imata enak lomni količnik kot steklo

Question 14

Kaj je fizikalna fiksacija?

Answer 14

• fiksacija tkiva s sušenjem ali zamrzovanjem
• sušenje je primerno za razmaze odvzetih tkiv, ne pa za debelejše vzorce tkiva

Question 15

Kako se ohrani struktura celic pri fizikalni fiksaciji?

Answer 15

• z zamrzovanjem, če bi kemijski fiksativi uničili ali spremenili lokacijo celičnih struktur
• najprej rahlo kemijsko fiksiramo, nato jih prepojimo s krioprotektivnim sredstvom, npr. OCT
• ZAMRZOVANJE NI NAČIN FIKSACIJE, AMPAK OMOGOČI REZANJE
• rezine se posušijo na zraku

Question 16

Kako poteka rezanje zamrznjenih rezin?

Answer 16

• v kriostatu
• ohlajen kriomikrotomski kovinski nož