2.1 - svetlobni mikroskopi

Question 1

Kaj lahko opazujemo s svetlobnim mikroskopom?
Kakšna je žarnica?
Kje se nahajata kolektor in kondenzor?

Answer 1

• obarvani histološki vzorci ali razmazi celic
• volframova ali LED
• pod objektno mizico

Question 2

Kaj lahko opazujemo s faznokontrastnim mikroskopom?
Kakšen je princip delovanja?

Kako izgledajo gostejše strukture?

Answer 2

• neobarvane preparate, strukture, procese
• razlike v fazi svetlobnega valovanja se spremenijo v razlike v amplitudi valovanja -> vidimo kot kontrast
• direktni žarki se ne uklonijo
• uklonski žarki se uklonijo
• temnejše

Question 3

Kako povečamo fazni zamik pri faznokontrastnem mikroskopu?
Kam padejo direktni in kam uklonski žarki?

Answer 3

a) kolobarjasta kondenzorjeva zaslonka:
- prepušča kolobar svetlobe, s katerim je osvetljen preparat

b) fazna ploščica:
- utor fazne ploščice je enakih dimenzij kot kolobar svetlobe

• direktni žarki padejo v utor
• uklonski žarki padejo na debelejši del fazne ploščice

Question 4

Kaj opazujemo s temnopoljnim mikroskopom?
V čim se razlikuje od svetlobnega mikroskopa?

Answer 4

• žive celice, neobarvane vzorce
• razlikuje se v sestavi kondenzorja: diskasta zaslonka zadrži centralne žarke, prepusti pa zunanji kolobar svetlobe
• vidimo svetleč obris na temnem ozadju

Question 5

Kaj opazujemo s fluorescenčnim mikroskopom?

Kateri sta tu ključni dve svetlobi?

Kakšen je kontrast s fluorescenčnim mikroskopom in kakšna je detekcija struktur?

Answer 5

• molekule, ki fluorescirajo –> absorbirajo svetlobo z več energije (krajša valovna dolžina) in oddajajo svetlobo z manj energije (daljša valovna dolžina)
• vzbujevalna in fluorescenčna svetloba
• vidno polje je temno, zato je vidna le fluorescenčna svetloba –> kontrast je dober, detekcija struktur je zelo natančna

Question 6

Ali pri fluorescenčnem mikroskopu molekule samo obarvamo?

Answer 6

• nekatere molekule, ki fluorescirajo, so lahko naravno prisotne
• načeloma obarvamo preparate s fluorokromi, ki jih vežemo na specifične molekule (npr. protitelesa) ali pa jih pripnemo v zapis na gene za specifične proteine in spremljamo njihovo dinamiko

Question 7

Katere so ključne prednosti fluorescenčnih mikroskopov?

Answer 7

1. možnost natančne lokalizacije struktur
2. možnost spremljanja dinamike procesov v živih celicah
3. razvoj vedno boljših fluorokromov

Question 8

Kako pri fluorescenčnem mikroskopu vzbudimo fluorescence v preparatih?

Answer 8

• s svetili (živosrebrova, ksenonova, LED)

Question 9

Kaj pri fluorescenčnem mikroskopu omogoča nastanek slike in varno delo?

Kako je sestavljen?
Kaj pomeni epifluorescenca?

Answer 9

FILTRSKI BLOK:
- vzbujevalni filter
- dikromatsko zrcalo
- zaporni filter

EPIFLUORESCENCA: preparat je osvetljen od zgoraj

Question 10

Kakšen je potek svetlobe pri fluorescenčnem mikroskopu?

Answer 10

1. emitirana fluorescenčna svetloba (vzbujevalna svetloba) potuje čez VZBUJEVALNI FILTER
2. odbije se od DIKROMATSKEGA ZRCALA proti preparatu
3. prečka objektiv in se odbije od preparata (fluorescenčna svetloba)
4. fluorescenčna svetloba znova prečka DIKROMATSKO ZRCALO in ZAPORNI FILTER, do okularja

Question 11

V čem se konfokalni mikroskop razlikuje od fluorescenčnega?

Answer 11

Konfokalni omogoča:
- večjo ločljivost
- mikroskopiranje debelejših preparatov
- 3D

TOČKASTO OSVETLJEVANJE:
- potrebujemo zaslonko z majhno odprtino (pinhole) in laser (vir svetlobe)
- detektor: zazna informacijo o intenziteti svetlobe na točki
- računalnik: sestavi sliko

Question 12

Kaj je optično rezanje?

Answer 12

• zajemanje slik več ravnin preparata
• z računalnikom jih lahko sestavimo v 3D

(konfokalni mikroskop)

Question 13

Kaj lahko gledamo s polarizacijskim mikroskopom?
Kaj je vir svetlobe?

Answer 13

• opazovanje dvolomnih struktur - zelo pravilno urejene molekule, npr. prečnoprogaste mišice
• polarizacijska svetloba

Question 14

Kakšna je zgradba polarizacijskega mikroskopa?

Kakšna je posledica te zgradbe?

Answer 14

• med virom svetlobe in preparatom je vgrajen POLARIZATOR, ki polarizira svetlobo
• med objektivom in okularjem je vgrajen ANALIZATOR, ki zadrži svetlobo, ki jo prepušča polarizator
• vidno polje je temno
• svetlejši deli: zaradi strukture preparata se je spremenila smer širjenja polarizirane svetlobe

Question 15

Kaj lahko opazujemo s stereoskopskim mikroskopom?

Katere so prednosti stereoskopskega mikroskopa?

Answer 15

• opazovanje manjših organizmov v celoti

Prednosti:
- velika delovna razdalja
- globinska ostrina
- vtis normalnega prostorskega gledanja - lažje opazovanje in rezanje organov in tkiv

Question 16

Opiši 2 podtipa stereoskopskega mikroskopa.

Answer 16

1. Klasični stereomikroskop:
   * opazujemo z obema očesoma hkrati
   * skozi 2 ločena objektiva in okularja
   * vtis globine - objektiva sta nameščena pod kotom 10-12°
2. Stereomikroskop:
   * en objektiv
   * žarki so usmerjeni v neskončnost

Question 17

Kako se stereomikroskop razlikuje od ostalih svetlobnih mikroskopov?

Answer 17

• pri stereoskopu je med objektivom in okularjem so dodatne PRIZME, ki sliko obrnejo in omogočijo normalno orientacijo
• osvetlitev je lahko od zgoraj, spodaj ali od strani
• NIMAJO KONDENZORJA

Question 18

Kaj lahko opazujemo z invertnim mikroskopom?
Kako je zgrajen?

Answer 18

• celice, gojene in vitro
• dolgotrajnejše spremljanje dinamike celičnih procesov
• objektivi so pod objektno mizico
• v spodnjem delu mikroskopa so prizme
• lahko je tako prirejen, da omogoča faznokontrastno in fluorescenčno mikroskopijo