2. Observations Microscopiques Des Microorganismes Flashcards
Qu’elles sont les deux types de microscope et quelles sont les grandes différences?
Photonique (optique) et électronique. Photon et électron. Les longueurs d’onde étant différentes, les grossissement le sont aussi.
Qui a inventer le microscope à fond clair et comment on détermine le grossissement?
Inventer par Kohler, agrandissement final = Objectif x Oculaire
Quelles sont les principales composantes du microscope à fond clair ?
Condensateur: Plusieurs systèmes de lentilles jouant sur la lumière incidente.
Objectif: 1er agrandissement de l’image
Oculaire: 2e agrandissement de l’image
Qu’est-ce que la limite de résolution?
Distance minimale entre 2 points pouvant être perçus distinct. Quand près de la limite = on ne différencie pas
Qu’est-ce que la résolution?
Capacité d’une lentille de séparer/distinguer les petits objets proches.
Qui a définit la théorie de l’optique d’un microscope ?
Ernest Abbé (1870). Développe l’équation de Abbé, donnant la distance minimale (limite de résolution)
Quelles sont les deux facteurs où l’on peut intervenir?
- Longueur d’onde: Visible= 400nm à 700nm UV= 180 à 400 nm. Il faut utiliser du quartz pour éviter l’opacité aux U.V. Proportionnel à l’indice de réfraction.
- Indice de réfraction: air = 1. Verre= 1.5. Huile= 1.56
+ indice est élevée, - faisceaux lumineux que l’on perd. Il y a 3 réfractions dans le microscope
Où les rayons lumineux sont focalisés
Foyer
Distance entre le centre de la lentille et le foyer
Distance focale
Quelles sont les limites du microscope à fond clair? (3)
- Limite de construction de l’objectif (1/2 angle du cône de la lumière entrant dans l’objectif)
- Limite de résolution de la lumière visible: Violet (400nm) = + grande résolution
- Le contraste : Qté de lumière absorbée par la structure vs. Milieu
Qu’est-ce que le contraste?
Capacité de distinguer une structure de son environnement
Qu’est-ce que la préparation à l’état frais?
Bien pour étudier la morphologie des organismes à grandes tailles, la motilité, l’axe de division cellulaire (protozoaires), corps d’inclusion cytoplasmiques
Pas pour observer bactérie (trop petit)
Avantage: cellules sont vivantes
Quelle moyen peut-on utiliser pour augmenter le contraste? Quelles sont les étapes?
La coloration (Peu de colorant vitaux):
- Fixation de l’organisme
- Flamme (séchage des structure sur la lame = tue les cellules)
- Ajout du colorant
Quelles sont les caractéristiques des colorants?
Chargés +/-, vont être choisis en fonction de la structure à observer.
Certains sont hydrophobes pour se loger dans les acides gras.
Quelles sont les deux types de coloration?
Coloration simple (un seul colorant) Ex; Bleu de méthylène (+), fréquemment utilisé, car affinité électrostatique, car plupart de Mo (-). Coloration uniforme.
Colorations différentielles
Quelles sont les deux types de colorations différentielles?
- Coloration de Gram (+/-)
- Alcoolo-acido-résistance (A.A.R) Par Ziehl et Neelsen. Permet l’identification des mycobactéries (temps de génération très lents)
Quelles structures peut-on bien visualiser avec la coloration différentielle? (4)
- Endospores
- Capsules
- Flagelle
- Corps d’inclusion
Qu’est-ce qui différencie le microscope à fond noir et à fond clair? (4)
- Le condensateur, écran sous le condensateur (Cône de Abbé( opaque , ne laisse pas passer la lumière)+ miroirs)
- Éclairage oblique
- Visualisation des rayons déviés
- Augmentation du contraste
Quelles sont les caractéristiques du microscope à contraste de phase ?
- Transforme les différentes densités(indice de réfraction) en différentes intensité lumineuse
- Mise en phase de la lumière incidente
- Halo de diffraction
- Image sombre sur fond clair
Quelles types de microorganismes peut-on observer au microscope à contraste de phase?
Visualiser les structures fines des organismes vivants (pas de coloration/fixation)
Qu’elle est la différence entre la microscopie à contraste de phase et les autres microscopes photoniques?
La présence d’anneaux de phase (dans le condensateur)
Présence de lame de phase (dans objectif)
Rayon non déphasé => Lame de phase. => Rayon déphasé
Qui a inventé le microscope à contraste d’interférence différentielle?
Nomarski , très récent $$$$
Caractéristiques microscope à contraste d’interférence différentielle.
- Polarisation de la lumière incidente (angle variable)
- Pseudo relief 3D
Réfraction de la lumière sur structures => Changement de polarisation => Différente intensité
Différences entre interférence différentielle et contraste de phase
- Pas de halo de diffraction
- Différent condensateur: Systèmes de lentilles polarisantes (ordinateur)
- Haut de gamme
Quelle est la limite du microscope à interférence différentielle
- Échantillon doit être transparent , sinon opaque= bloque la polarisation de la lumière
Quelles sont les caractéristiques du microscope à fluorescence/(épi)fluorescence? Quelle est la différence entre les deux ?
-Éclairage avec lumière UV
-Utilisation de colorants fluorescents (fluorochromes)
-Fluorochromes absorbent UV
-Observe ce qui est dévié
-Filtre sélectif
-Miroir Dichroique (deux couleurs) Uv et ensuite lumière visible réfléchi par l’échantillon
-Uv ne traverse pas le verre
Différence: Épi : rayon vont vers l’échantillon et pas vers le haut
Pour qu’elle raison y-a-t’il un filtre sélectif dans le microscope à fluorescence?
Il sert de bloquant
Quelles sont les différentes applications de la microscopie à fluorescence?
- Fluorochromes vitaux : Distinction cellules vivantes/mortes
Vivantes: Exclusion par la membrane cytoplasmique
Mortes: Membrane cytoplasmique perméable - Immunofluorescence: Couplage anticorps + fluorochromes (détection pathogène,diagnostic)
3.Hybridation Fluorescente in situ (FISH) :Quantification des proportions, analyse informatique d’images. Sonde d’ADN+ Fluorochromes pour distinguer exclusivité espèceetc. (Cellules mortes)
Que pouvons nous observer au microscope électronique?
Très petits organismes (virus). Très grand grossissement, car longueur d’onde des électrons bcp plus petites que photos.
En quelle année a été inventé le microscope électronique ?
1931 Par Ruska
Quelles sont les parties d’un microscope électronique et qu’elles matériaux sont utilisés?
Condensateur, objectif et oculaire: électroaimants et lentilles magnétiques. Rien en verre, car bloque les électrons.
Comment est créée l’image dans la microscopie électronique?
Écran fluorescent, plaque photographique et détecteur numérique.
Quelles sont les limites du microscope électronique (3)
- Les électrons voyagent dans le vide. (Donc matériel, non vivant)
- Les électrons sont non-pénétrants. (Coupe ultrafine, pour que les électrons traversent 20-100nm)
- Le matériel vivant est non électron-dense, il n’y a pas de différence de densité = transparent)
Quelles sont les 4 techniques de préparation/coloration pour la microscopie électronique?
- Technique de l’ombrage: On projette une ombre en vaporisant des métaux sous un angle précis de 45 degrés. Billes témoins pour mesurer l’ombre
- Coloration négative: Acide phosphotungstique s’accumule dans les creux, donc créé de (creux : sombre , Protubérances: claires). Bien pour observer les virus et les vacuoles gazeuses bactériennes.
- Cryodécapage: Congélation rapide à l’azot liquide sous-vide. Observer le relief à l’intérieur d’une structure. Coupe transversale + technique de l’ombrage.
- Immuno-localisation cellulaire: Utilisation de billes de Fe ou Au : Accumulation des billes lorsque les anticorps les reconnaissent.
Quelles sont les deux types de microscope électronique?
- Microscope électronique à transmission
2. Microscope électronique à balayage
Caractéristique microscope électronique à transmission.
- Les é traversent l’échantillon et le détecteur est sous l’échantillon.
- On voit au travers la cellule
- Échantillons doivent être coloré et sous-vide = cellules mortes
- La plus faible limite de résolution, structures très fines
- Des électro-aimants en forme d’anneau focalisent le faisceau électrique
Caractéristiques microscopie électronique à balayage
- La coloration imprègne seulement la surface
- Balayage de la surface (effet 3D)
- Les MO doivent être séché et mis sous-vide (cellules mortes)
- Grande limite de résolution
- Détecteur latéral
Autres microscopes récents
- Cryélectromicroscope : Congélation rapide par éthane et azote. (Vitrification de l’eau)
- Cryotomographie: Échantillon solide congelé. Images en strates pour reconstitution 3D
- Cryo-EM: Modélisation des structures protéiques (Spike, SARS-CoV-2-ACE2)
Comment fonctionne le microscope confocal à balayage laser ?
- Microscope photonique
- Utilisation de fluorochromes, absorbent énergie UV et émettent dans le visible.
- Élimination de la lumière UV provenant des plans hors foyer
- Laser à balayage horizontale, vertical et temporel(strates). (Évolution vs. Temps 4D)
Comment fonctionne le microscope à effet tunnel ?
- Sonde qui balaie la surface et qui mesure les variations de courants/nuages électroniques
- Sonde pas toujours à la même distance de la surface. (utilisage courant tunnel)
Microscope à force atomique
- Balayage de sonde
- Maintient constant la distance entre la pointe de la sonde et la surface
