13. PCR Flashcards
Historia de la PCR
- desarrollado por Kary Mullis (1993)
- ayudó para estudiar y manipular el DNA
- es el primer paso para la identificación de mutaciones genéticas
En qué se ocupa la PCR
- expresión génica
- genotipificación
- detección de patógenos
- análisis de mutaciones
Definición de PCR
- REACCIÓN ENZIMÁTICA IN VITRO
- objetivo: amplificar millones de veces una secuencia específica de ADN
Se hacen 2 nuevas hebras de ADN a partir de 1 que funciona como molde
Parecido a la replicación celular
OCUPA LA ENZIMA ADN POLIMERASA
¿Cómo se hace esta amplificación?
- se ocupa cambios de temperatura por un termociclador
- los ciclos de temperatura se repite entre 25-35 veces
Tipos de PCR
- ADN genómico → PCR
- ADN complementario → RT-PCR
Generalidades de la RT-PCR
Se ocupa ADN complentario que viene del ARNm
* se ocupa la transcripción reversa por la transcriptasa reversa
* se copio de los retrovirus
* se analiza la expresión del ARNm
Elementos de la PCR
- Templado o molde (ADN o ADNc)
- enzima
- cebadores
- desoxirribonucleótidos trifosfatados
- Ión magnesio
- solución amortiguadora o buffer
- agua destilada o desionizada estéril
¿Qué es la muestra en una PCR?
- puede ser ADN o ARN
- para evaluar su integradad se tiene que poner en un gel de agarosa
Se hacen la:
1. desnaturalización: sepera las cadenas de adn
2. templado: se enfría la cadena y hace que las secuencias complementaria se una el molde de ADN
3. extensión: se eleva la temperatura para que funcione la Taq polimerada y extienda los cebadores y sintetice las cadenas de ADN
ADN polimerasa
- cataliza la reacción de sintetizar la nueva cadena
- DNA polimerasas termoestables
- Taq ADN polimerasa: la más coupada, aunque no tiene actvidad correctora
¿Qué otras polimerasas hay?
- Vent: viene de Thermococcus liitoralis
- Pfu: Pyrococcus furiosus, tiene actvidad correctora 👑
Cebadores
- Reconocen el sitio de inicio de la amplificación del DNA
- Son secuencias de oligonucleótidos de 16-24 nucleótidos de longitud
Se pueden crear con ayuda de:
* GeneFisher
* PrimerBLAST
Tipos:
1. sentido
2. antisentido
Son características de los cebadores
- relación máxima de pruina/pirimidinas 40-60%
- deben de evitar zonas con más de 3 repeticiones consecutivas de una sola base
- no seleccionar cebradores que en su extremo 3’ tenga una estructura importante
- en el extremo 3’ debe haber bases G o C
- que no se una con otros cebadores: formación de dímeros
- su T° de alineamiento debe ser similar entre los dos
dNTP’ s desoxirribonucleótidos trifosfatados
- la Taq polimerasa la ocupa para construir la nueva cadena
- ayudan para la especificidad de la reacción
Si hay una ⬆️ concentración disminuye especificidad y fidelidad
Si hay ⬇️ minimiza la incorporación de errores
Ion magnesio
- cofactor para DNA polimerasa y ayuda para la especificidad
- lo optimiza el cebador
- su concentración debe ser mayor que los dNTP’s
- puede venir incluido en el. buffer
Función de buffer
- solución amortiguadora
- concentración al final debe ser 1X
-puede afectar la Tm
Etapas de la PCR
- desnaturalización
- hibridacion
- extensión
¿Qué significa desnaturalización?
Hace que el DNA de doble cadena se separe en dos cadenas sencillas a u temperatura 95º durante 20-30 seg.
* el tiempo depende de la secuencia de templado (⬆️ GC = ⬆️Tº
* se ocupa el ramping
¿Qué es la hibridación?
Al disminuir la temperatura se unen los inciadores con el ADN molde en las zonas 3’ complementarias
¿Qué es la extensión?
- se conoce como elongación, amplificación o polimerización
- Taq polimerasa actúa sobre el complejo-cebador y realiza su función catalítica
- agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN en dirección 5’ a 3’
Al final se forman lo amplicones
Razón del éxto de la ADN polimerasa
Sinstiza sólo la región flanqueada por los cebadores y permite obtener fragmentos muy específicos y aíslados del resto del genoma
Es la extensión final
Última extensión de 5 min
OBJETIVO: hace que la polimerasa sintetiza los fragmentos que puedieron haber quedado incompletos
Análisis de la PCR
Se visualiza por electroforesis:
Separación de grandes moléculas en base a su tamañao y carga eléctrica por una matriz sólida en un campo eléctrico
* se ocupa agarosa o poliacrilamida
* se hace bajo un tampón o buffer: TAE o TBE
