10- diagnostic moléculaire génétique 6 Flashcards
qu’est ce qu’un diagnostic moléculair ?
diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigénome
donner structure acide nucléique
sucre+phosphate+base
charge ADN
négative
nombre de lien hydrogène pour GC
3
nombre de lien hydrogène pour AT
2
en amont du côté 5’ nous avons…
promoteur (codon d’initiation)
qu’est ce qu’une varibialité non pathologique?
toute divergence de séquence ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associé à une pathologie génétique
qu’est ce qu’une variabilité pathologique?
MUTATION: changement permanent et transmissible de la séquence ADN causant un phénotype pathologique
une varibialité non pathologique peut-être utile pour..
greffes par exemple!
voir si le patient va rejeter ou non
nombre de variations entre le génome d’un individu et celui de référence
5 à 6 millions
de ces 5 à 6 millions, combien arrive de novo? (absent chez les parents)
70 surveinnent de novo
est-ce que toutes les 5 à 6 variation géné millions ont un impact sur phénotype?
NON
- surviennnet dans régions non codantes (intergéniques, introns) sans affecter expression du gène
- Elles sont despolymorphismes fréquents
- touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
causes externes de variations génétiques
radiations
uv
cliniques (agents alkylants; chimie)
causes internes variations génétiques
- dépurination
- déamination
- radicaux libres
- erreurs de la polymérase (transcription)
- erreurs réplications et recombinaison
- méthylation
quel endroit est fréquent pour des mutations?
dinucléotides CG (ilots CpG) -C devient méthyle -mehtyl C devient U -U code pour T (20 fois plus fréquent que les autres mutations)
Types de variations non pathologique selon taille du génome; GRANDE
CNV, LINE
variations non pathologique selon taille; MOYENNE
microsatellites
*séquences répétées (souvent cacacacaca)
variations non pathologique selon taille;PETITES
- SNP 1 position de différence par rapport au génome de référence (arrive à tous les 100 nucléotides/single nucleotides polymorphismes ) , - indels (délétions)
les petits réarrangement des variations géné pathologique peuvent être de types… (3)
- substitution (transition et transversion)
- insertion (mutations dynamiques=triplets)
- délétion
les grands réarrangements peuvent être de type … (3)
- insertions
- délétions
- équilibrés
mode de mutation le plus fréquent
**substition
conséquence variation homologue
change un codon pour un autre codant pour le même aa
=silencieux
conséquence variation faux sens (missense)
change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
*plus difficile; peut causer une maladie ou non
quelle est exception d’une variation homologue, la rendant non silencieuse
si interfère avec le site consensus= interfère avec l’épissage
conséquence variation de l’altération du cadre de lecture (frameshift)
insertion ou délétion qui n’est pas un multiple de 3
=modification du codon et de ceux en aval (souvent introduction d’un codon STOP prématuré)
conséquence variation non sens
change le codon pour un codon stop
est ce qu’une variation non sens pourrait ne pas avoir d’impact?
oui dans les grosses protéines mais normalement, sont pathogénique
variation faux sens est pathologique ou non?
variable
variations non sens et frameshift; pathologique ou non?
habituellement pathologique
quels sont les éléments à considérer pour savoir si une variation est pathologique ou non?
- fréquence population (si c’est rare = patho, si c’est fréquent = bénin)
- conservation (retrouvé chez d’autres organisme )
- impact ARNm
- impact protéine
- fonction gène
variation homologue; pahtologique ou non?
normalement non
type de gène uniquement exprimé à état homozygote
récessif
type de gène exprimé à état hétérozygote
dominant
qu’est ce qu’une perte de fonction?
réduction dans la quantité de protéine produite ou réduction de l’activité de la protéine
=entraine le phénotype
qu’est ce qu’un gain de fonction?
augmentation dans la quantité de la protéine produite, augmentation de l’activité de la protéine ou une nouvelle fonction de la protéine entraine le phénotype
quels mécanismes sont associés à des gains de fonctions?
- augmentation du dosage génique
- altération de l’expression ARNm
- activité accrue de la protéine
- nouvelle fonction protéine
- altérations toxiques à la protéine
un individu avec un X fragile pourrait avoir un enfant sain?
OUI
mais dépend de son génotype
-si normal; ok
-si prémutation; son enfant pourrait avoir la maladie
quelles maladies ont des expansions TRÈS grandes?
Steiner, x fragile, friedreich
*mutation dans une portion non codante du gène (UTR, introns)
quelles maladies ont des expansions petites?
Huntington, SCA1, DMOP
*mutation dans portion codante (exon)
but de l’isolation de ADN
isoler ADN du reste du contenu cellulaire (on retrouve beaucoup de protéines…)
**on se sert des caractéristiques spécifiques de ADN par rapport au reste du contenu cellulaire
décire la technique sels chaotropiques pour isoler ADN
- ADN se fixe à la colonne de verre/membrane
- le reste (protéines, lipides, HC charge neutre= sont solubles dans l’eau)
- Non toxique et automatisable
Décrire la technique de phénol-chlorophorme
- Acides nucléiques charge (-): hydrosolubles
- Protéines, lipides, HC charge (neutre): phase organique
- Tpxique et peu automatisable
comment évaluer l’efficacité de l’isolation par densité optique?
on estime la quantité de ADN par le ratio 260 (absorbance max ADN)/280 (absorbance max protéines)
**estime pureté
comment évaluer l’efficacité de l’isolation de ADN par teintures intercalantes?
- SYBR Green, Pico Green, bromure d’éthidium
- composés qui se fixent à AND double brin
- estimation de la quantité et de la taille de ADN
qu’est ce que le principe d’hybridation?
construire une séquence de nucléotides complémentaires à une portion ADN du patient (sonde)
Elle est marqué (fluroescence, radioactivité)
LA détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
qu’est ce que le principe de l’électrophorèse capillaire?
séparer les molécules ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel d’agarose
(migre moins loins si gros)
qu’est ce que la technique Buvardage Southern?
technique qui combine électrophorèse sur gel de ADN génomique fragmenté à l’hybridation par une sonde marquée complémentaire à ADN cible
donner les étapes du Buvardage Southern
1-digestion ADN génomique 2-électrophorèse capillaire 3-transfert sur membrane 4-hybridation 5-détection par autoradiographie
à quoi sert la technique Buvardage Southern?
permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
composantes pour PCR aka photocopie moléculaire
- ADN patient
- amorces; oligonuclétodies permettant a la réaction de commencer
- polymérase
- nucléotides
- tampon (ions, mg)
- autres additifs si nécessaires
meilleure ADN polymérase?
Taq 8X10^6
**toutes les polymérases peuvent faire des erreurs
comment ce déroule un cycle de PCR?
dénaturer hybrider (refroidie) dénaturer (réchauffe) **passe de simple brin à double brin =on double quantité ADN à chaque cycle
comment trouver le nombre de molécules ADN produites par PCR?
2^n puisque le PCR fait doubler le nombre d’ADN à chaque cycle
*n=nombre de cycles de pcr
but du PCR migration
permet de détecter les insertions ou les délétions
*électrophorèse capillaire des produits PCR
=détection du signal; la distance ou se situe la bande par rapport au puit réflète sa taille
applications du PCR-migration
- analyses d’identités génétique;
instabilités des micro satellites,
contaminations foeto-maternelle,
judiciaire
- *insertions et délétions récurrentes
principe du PCR-digesiton
digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnait une séquence spécifique
*mutation crée ou abolit site de restriction
EcoR1 coupe à …
G_AATTC
DraI coupe à ..
TTT_AAA
applications du PCR digestion
mutations ponctuelles récurrentes
*on trouve un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
est-ce qu’un mismatch en 3’permet une extension?
Allele Specific Primer Extension
non!
extension seulement si match en 3’
nom de la technique incluant un appareil d’électrophorèse très complexe permettant une précision de 1 nucléotide? et comment fonctionne t elle
- séquencage de Sanger
- Amplification PCR
- Dénaturation
- Réamplification avec mélange de nucléotides et de nucléotides modifiés qui sont marqués par la fluorescence
dans le séquençage de Sanger, comment la chaine se termine?
- didésoxyribonucléotides (ddNTP) ne contient pas de OH au segment C3 du ribose!
- L’incorporation du ddNTP vs le dNTP est aléatoire
empêche de se lier au prochain désoxyNucléotide TriPhosphate (dNTP)
Séquençage Sanger - applications
Séquençage Sanger - applications
* Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène
* Méthode de choix pour substitutions
* Bonne méthode pour petites insertions ou délétions
* Ne détecte pas les grandes anomalies de dosage
quelle est la caractréstique d’un PCR en temps réel?
réaction PCR et détection du produit en simultanée!
*discrimination allélique et quantification (relative/absolue)
comment fonction la sonde TaqMan?
- sonde possède un rapporteur et un quencheur (partie de la sonde qui sert à étouffer la fluorescence est tombe quand elle se lie à l’ADN)
- sonde se lie à ADN et à l’amorce
- Taq libère rapporteur= fluorescence
PCR temps réel pour discrimination allélique
Discrimination allélique
* amorce marquée
* sonde marquée
Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations
selon la méthode de PCR en temps réel, un échantillon prend 24 cycles pour atteindre le seuil de flurescence (RFU) et le deuxième prend 25 cycles. quel échantillon avait le plus ADN?
le premier!
le deuxième avait 2 fois moins ADN au départ
Ca sert à et donner les étapes de la technique de PCR Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA)
Méthode pour la recherche de délétions/duplications
Sonde en deux sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider côte-à-côte sur l’ADN du patient
Ligase scelle ensuite les 2 sous-unités
Amplification PCR
Électrophorèse capillaire
- dénaturation
- hybridation des 2 portions de la sonde (1 nucléotide de distance)
- ligation des 2 portions de la sonde par ligase
- amplification PCR de la sonde fusionnée
- électrophorèse capillaire
avantages d’un séquençage de nouvelles générations? SNG
Moins dispendieux
-multiplier infos obtenus par analyse
-possible d’analyser plusieurs gènes, voir plusieurs patients en même temps (codes barres moléculaires!!)
(on compartimente le séquençage)
Étape du séquençage de la nouvelle génération
1 - Fragmentation de l’ADN (sonication, nébulisation et digestion)
2- Liaision à un adapteur (un code barre moléculaire)
3- On fait une capture pour retenir les séquences spécifiques du génome
4- On fait une amplication en parallèle (PCR-émulsion et PCR-cluster)
5 - Séquneçage en parallèele
que ce passe t-il à l’étape d’analyse bioinformatique 1?
génération de plusieurs milliers de séquences d’environ 100 à 150 pb
=les séquences peuvent être attribuées à chaque patient selon un code barre moléculaire
que ce passe t-il à l’étape d’analyse bioinformatique 2?
- alignement des séquences au bon endroit du génome humain
- voir si varation
- estce que ces variations sont pathologiques
- est-ce que les variations présentes sur gènes peuvent expliquer le phénotype de patient
combien avons nous de régions qui contient des régions codantes (exons) et de MB et de nucléotides dans exome?
Le 1% du génome qui contient les régions codantes (exons)
- 3GB x 1% ~ 30MB
- 30M nucléotides (soit 20 000 variants)
La 2e application de la SNG est l’anlyse de d’ADN foetal circulant comment ca fonctionne
- 10% de l’ADN circulant de lmère provient du foetus
- C’est produit par l’unité placentaire
- Courte taille
- Courte temps de demie-vie
- Pour par exemple les trisomie 21
la technique de PCR migration est bonne à utiliser pour trouver…
insertion/del
la technique PCR digestion est bonne à utiliser pour trouver…
mutations ponctuelles récurrentes
le séquencage Sanger est est bonne à utiliser pour trouver…
grande nbre mutation dans 1 gène
substition
petites insertion/del
detecte pas de grande anomalie
la technique MLPA
deletion ou duplication
