06 - (COMPLET) Diagnostic moléculaire et maladies génétiques Flashcards
Quel serait le test parfait pour diagnostiquer une maladie?
+ : personne malade
- : pas malade
Existe-t-il un test parfait?
Non :(
Qu’est-ce qui a permis l’essor de la biologie moléculaire?
- Techniques d’amplification PCR
- ++ connaissances et des banques données séquence génome organismes
- Caractère génotypique analyse
Quel est l’intérêt du diagnostic génotypique par analyse de l’ADN?
Indications impossibles par diagnostic phénotypique (dosage protéine spécifique)
Nommez un exemple de tests génétiques basés sur les méthodes de diagnostic moléculaire.
- Test présymptomatiques en période prénatale
Qu’est-ce qui permet un diagnostic précoce?
L’utilisation de sondes nucléiques
Quelle voie de la médecine s’est ouverte grâce au diagnostic moléculaire?
Médecine axée sur la prévention des maladies
Où est présent l’ADN?
Dans toutes les cellules nucléées.
Quelles sont les deux types d’analyse de l’ADN?
Génotypique et phénotypique
Que permet l’analyse génotypique que l’analyse phénotypique ne peut pas?
Exploration produits expression + leurs effets biologiques.
L’application d’un des types d’analyse de l’ADN se fait dans quel contexte?
Perturbation héréditaire ou acquise ADN/ARN
Nommez une situation où l’analyse génotypique est un avantage.
Lorsque le gène en cause + son produit non identifiés
Qu’est-ce qui doit être connu pour faire une étude directe?
Identification du gène de la maladie et de la mutation responsable
Quel type d’étude est réalisé si le gène n’est pas cloné ou la mutation responsable n’est pas identifiée?
Étude indirecte (marqueurs polymorphiques ségrégent allèle délétère)
De quoi dépend le risque de maladies monogéniques pour une famille donnée?
Distance du marqueur au locus de la maladie.
Quelle est la condition pour étudier une maladie par biologie moléculaire?
Disponibilité marqueur adéquat permettant reconnaître gène ou région liée
Quels sont les 2 types de marqueurs génétiques?
Les sondes directes et indirectes
À quoi correspond la sonde directe?
Au gène étudié
Que reconnait la sonde indirecte?
Des polymorphismes (SNPs, microsatellites) génétiques liés au locus d’intérêt
Quels sont les 5 types de sondes directes?
- cDNA
- DNA génomique
- ribosondes
- oligonucléotides de synthèse
- DNA étrangers (bactéries, virus, parasites)
Trouvez les termes
À partir de quelles cellules ne peut-on pas extraire de l’ADN?
Érythrocytes matures et plaquettes (pas de noyau)
Nommez de bons endroits où extraire de l’ADN
Liquide amniotique, sang périphérique, racines des cheveux, foie, etc.
Quelles sont les 4 principales techniques utilisées en biologie moléculaire?
- Dot blot
- Southern blot
- Séquençage
- Amplification par PCR
Quelles sont les 3 phases principales d’une technique d’analyse de l’ADN?
- Préparation prélèvement biologique pour extraction + purification ADN/ARN
- Réactions de synthèse d’ADN et/ou d’hybridation ADN purifié
- Révélation réactions par autoradiographie, comptage radio-isotopique, chimioluminescence, fluorescence
À quoi servent les enzymes ?
Induisent synthèse/ fragmentation/modification in vitro des acides nucléiques
Quelles sont les 2 étapes principales du buvardage de Southern?
- ADN fragmenté par enzyme de restriction
- Séparation des fragments par électrophorèse
Comment la méthode du buvardage de Southern permet d’identifier des polymporphismes de restriction?
Toute variation génétique modifiant un site de coupure empêche la fragmentation normale.
Pourquoi la PCR est révolutionnaire ?
Limite de sensibilité est une cellule (Southern nécessite 300 000 cellules)
Que permet la PCR?
Amplifier séquence spécifique ADN in vitro
Est-ce que le diagnostic direct nécessite une étude familiale préalable?
Non!
Que nécessite le diagnostic indirect?
Calcul de risque
Quelle approche diagnostique est privilégiée?
Diagnostic direct
Pourquoi le diagnostic direct est d’un grand intérêt?
Spécificité et fiabilité
Que détecte le diagnostic direct?
Hétérozygotes (porteurs)
Dans quel cas la sonde spécifique ou l’amorce PCR s’hybrident lors de l’hybridation spécifique?
SI correspond parfaitement à la séquence cible
Quels sont les désavantages de l’hybridation spécifique?
-Spécificité
-Conditions expérimentales optimales
Quelles versions sont utilisées pour l’hybridation spécifique?
Sauvage et mutée
Quelle est la procédure inverse de la succession d’hybridations?
Reverse dot-blot
Dans le reverse dot-blot, qu’indique l’apparition d’un seul ASO?
Nature de la mutation
Nommez un exemple de reverse dot-blot
Micropuce de génotypage
Quelle est cette méthode?
Amplification allèle-dépendant : amplifie si appariement parfait
Nommez les étapes du séquençage
Quel est le principe de l’analyse indirecte?
Distinguer le chromosome porteur gène pathologique d’homologue normal
Quelles sont les limitations intrinsèques de l’analyse indirecte?
Informativité et recombinaison
Qu’est ce que l’informativité?
Potentiel de détecter des hétérozygotes
Que permet la connaissance de la fréquence des allèles de chaque marqueur dans la population?
Connaître d’avance la proportion des familles bénéficient analyse
Qu’est-ce qui facilite la tâche d’informativité?
- Microsatellites hautement polymorphiques
- Plus grande densité de SNPs
Qu’est-ce qui est étudié au sein des familles par analyse indirecte?
Ségrégation des marqueurs polymorphiques (co-ségrégation)
Quel est le problème majeur de la recombinaison?
Peut conduire à un diagnostic erroné si passe inaperçue
Comment détecter la recombinaison?
Utiliser un second marqueur de l’autre côté de la lésion
Si l’on explore 2 marqueurs situés de part et d’autre de la lésion, que visualise-t-on?
Changement de phase produit par une recombinaison simple (double passerait inaperçue)
Peut-on diagnostiquer en présence de recombinaison simple? Qu’est-ce qui pourrait y remédier?
NON!
Analyse polymorphismes (long, utilise ++ sondes différentes)
Comment est, au final, le diagnostic génotypique par polymorphisme lié?
Nature probabiliste
À quoi sert la détection des hétérozygotes?
Déterminer constitution génétique par analyse ADN chez des individus déjà nés
Les indications du diagnostic génotypique d’hérézygotie concernent qui?
- Histoire familiale de la maladie
- Porteurs sains susceptibles de transmettre la maladie
- Porteurs non encore malades maladies dominantes révélation +/- tardive
Quand pratique-t-on le diagnostic prénatal?
Si risque que foetus soit atteint
À quoi peut conduire le diagnostic prénatal?
- Traitement enfant in utero
- Prise en charge dès naissance
- Interruption grossesse si anomalie grave
Nommez des avantage de l’accès précoce à l’ADN foetal.
-Interruption de grossesse fin 1er trimestre moins traumatisante
- donne temps biologiste moléculaire
À partir de quoi est préparé l’ADN foetal?
Amniocytes et trophoblastes
Quand recueille-t-on les amniocytes par amniocentèse?
17eme semaine
Quand recueille-t-on les trophoblastes?
Entre 8eme et 12eme semaine
Est-ce que la biopsie d’où l’ADN foetal est extrait peut contenir un tissu d’origine maternelle?
NON!
Pourquoi les trophoblastes sont priorisés pour l’ADN foetal?
Qte suffisante sans culture préalable
Quelle semaine de la grossesse pour le sang du cordon?
22eme semaine
Quel délai pour diagnostic direct?
Courts (un/quelques jours)
Quel délai pour un diagnostic semi-direct ou indirect?
Moyens (1-2 semaines)
Quels délais pour situations où information est difficile à obtenir?
Longs (plusieurs semaines)
Le diagnostic génétique préimplantatoire (DGP) permet d’analyser le contenu génétique de quoi?
Embryon humain obtenu par fécondation in vitro
Le DGP est un avantage pour qui?
Couple à haut risque de transmettre maladie génétique grave
Vrai ou faux : le DGP permet de sexer les embryons
Vrai!
Le DGP fait appel à quelles techniques?
- FIV
-Analyse contenu génétique d’une seule cellule
Outre la PCR, quelle technique permet la visualisation de chromosomes sur une seule cellule?
Technique d’hybridation in situ fluorescente (FISH)
Donnez des raisons d’appliquer les diagnostics moléculaires.
- Suivi grossesse
- Thérapeutique
- Risque génétique médical
Lors de maladies récessives liées au sexe, à quel état est la manifestation?
Hémizygote (mâles 1 seul chromosome X)
Comment sont les femmes porteuses?
Hétérozygotes et asymptomatiques
Qu’est-ce qui est absent chez les personnes hémophiliaques?
Facteur de coagulation
Quels sont les deux types d’hémophilies et leurs pourcentages?
Hémophilie A : 85% (1/5000)
Hémophilie B : 14% (1/30000)
Quel facteur est déficitaire selon le type d’hémophilie?
A : facteur VIII
B : facteur IX
Comment diagnostiquer l’hémophilie?
Échantillon de sang foetal
De quoi dépend la sévérité de l’hémophilie?
Concentration des facteurs de coagulation (formes sévères, modérées ou légères)
Quels types de mutations affectent le facteur VIII?
Délétions et mutations ponctuelles
Qu’est-ce qui mène aux formes sévères et modérées?
Modérés : mutations faux-sens
Sévères : non-sens et délétions
Qu’est-ce qui cause une inversion?
Recombinaison homologue
Qu’arrive-t-il au gène du FVIII après l’inversion?
Divisé en 2 parties
Pourquoi la caractérisation des mutations ponctuelles est difficile?
- Grande diversité
- Taille du gène
- Structure très morcelée
Qu’est-ce qui augmente les possibilités de diagnostic chez la majorité des hémophiles?
Utilisation des polymorphismes de répétition CA (microsatellites)
Quels sont les problèmes de diagnostic de l’hémophilie?
- Familles restent non-informatives
-Informatives pour polymorphismes extragéniques
Qu’est-ce que la néomutation?
Mutation survenue dans un gamète
Fréquence de néomutation est pour combien de gènes?
Un seul
De quoi dépend la fréquence de néomutation?
- Taille du gène
- Sensibilité séquence ADN
- Âge du parent (augmente fréquence)
Quelle est la difficulté avec les cas de néomutations chez les hémophiles?
Presque impossible de déterminer si mutation produite chez mère ou hémophile
Quelle est la plus grave et fréquente des dystrophies musculaires progressives?
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)
Qui exprime la maladie recessive DMD?
Garçons par le chromosome X, femmes peuvent être porteuses
Quelle forme de dystrophie est plus tardive et évolue plus lentement?
Dystrophie musculaire de Becker (BMD)
Quelle dystrophie est la moins fréquente entre Becker et Duchenne?
Becker est dix fois moins fréquente que Duchenne
Quel gène est affecté par les myopathies de Duchenne et de Becker?
Dystrophine
DMD/BMD:
Localisé en (?)
Il contient (?) exons
Le gène DMD code pour (?)
- Xp21.2.
- 79 exons
- une protéine de soutien du cytosquelette
sous-membranaire du sarcolemme –> dystrophine.
Le diagnostic de DMD/BMD
but:?
le diagnostic prénatal et celui des
femmes porteuses (les
femmes qui ont un risque d’avoir reçu le chromosome X anormal présent chez le ou les myopathes de la famille)
Le diagnostic phénotypique est (?)
Le diagnostic génotypique est (?)+moyens
Ne s’adresse qu’aux
(?)
- possible
- irremplaçable, moyens: direct, semi-direct
- malades
La délétion de DMD ne respecte plus (?), formation d’un (?)
la phase, codon stop\
Les délétions responsables de la BMD se font sans (?)
abolition du cadre de lecture–> une dystrophine raccourcie
Test direct: Détection des délétions, Fréquence?
Environ 60 % des cas
petite taille, ne pas passer à côté d’anomalies situées au début ou à la fin d’un exon, il faut placer les amorces d’amplification (?) que l’on veut explorer.
en dehors et de part et d’autre
de l’exon
Méthode « PCR multiplex »: En pratique, on effectuera premièrement une exploration des (?) par PCR
exons les plus souvent délétés
Lésions plus subtiles qui ne peuvent pas etre detectee
- micro-délétions
- mutations ponctuelles
Utilisation pour le diagnostic prénatal soulève deux types de difficultés
1) Risque de recombinaison proportionnel à la distance entre le marqueur et la mutation.
2) Lourdeur de l’investigation lorsqu’elle doit être effectuée sous la contrainte temporelle du
diagnostic prénatal.
femme qui a Mosaïque gamétique, consequence?
la possibilité d’une
transmission inattendue de la maladie à plusieurs enfants par une mère apparemment non porteuse
*Accident mitotique survenu:
- cellules précurseurs des gamètes
– stade précoce de l’embryogenèse
–2 populations de
cellules dans tous les tissus , y compris dans la lignée germinale.
MALADIE AUTOSOMIQUE RÉCESSIVE: Le cas index doit être étudié pour :
- Identifier la lésion (méthode directe)
- Identifier deux chromosomes par des polymorphismes intragéniques (méthode indirecte).
- 2 parents doivent être étudiés.
L’étude des gènes autosomiques responsables d’une pathologie(?) se heurte à une difficulté intrinsèque
– L’impossibilité de distinguer les (?), porteurs sains du trait
génétique, des (?) normaux.
- récessive
- hétérozygotes, homozygotes
HÉMOGLOBINOPATHIES
Toutes les situations anormales possibles ont été retrouvées au niveau du gène de l’hémoglobine .
La génétique moléculaire a permis (?)
Permet le (?) par analyse du DNA.
- de préciser la nature des mutations nucléotidiques, déjà suspectées
- diagnostic prénatal
Il s’agit dans la majorité des cas de substitutions de (?)
d’un seul acide aminé
dans la chaîne a ou b.
ANÉMIE FALCIFORME
due à l’avantage sélectif vis-à-vis du
paludisme que confère l’hétérozygotie A/S, fréquente dans les populations d’Afrique, expression diffère, totalement homogène: mutation est identique.
HÉMOGLOBINE S
* L’hémoglobine S est
- la mutation la plus grave
- répandue en Afrique tropical
- Caractérisée par une substitution de l’acide glutamique par une valine en position 6 sur la chaîne b de la globine.
- déformation des hématies bouchent les petits vaisseaux
AUTRES VARIANTES DE L’HÉMOGLOBINE
- Hémoglobine C (Afrique de l’Ouest): Mutation Bc: GAG (glu)→AAG (lys) dans le 6e codon.
- Hémoglobine E (Asie du Sud-Est).
LE DIAGNOSTIC GÉNOTYPIQUE
* Le diagnostic génotypique de la mutation Bs ne se justifie que dans un contexte (?)
prénatal, surtout à un stade précoce
LE DIAGNOSTIC GÉNOTYPIQUE
Peut être effectué par 2 méthodes directes :
- Méthode PCR-ASO : oligosonde dont on utilise les deux
versions, normale et mutée
❖ la version normale hybride avec la séquence Ba, et la sonde avec séquence Bs - Méthode PCR-RFLP : À l’aide de l’enzyme de restriction reconnaît et
clive spécifiquement une séquence comportant le 6 e codon du gène B dans
sa version normale.
❖ La mutation A→T dans le 6
ème codon (CCTGAGGAG→CCTGTGGAG)
de la b-globine abolit un site normalement reconnu et coupé par Dde I, et par Mst II
LA FIBROSE KYSTIQUE (MUCOVISCIDOSE)
* La fibrose kystique s’exprime (?)
lorsque la mutation est présente à l’état homozygote, les deux allèles sont porteurs d’une mutation délétère.
la plus fréquente origine européenne
FIBROSE KYSTIQUE :
- La maladie entraîne une pathologie des (?)
- 85%. manifestations digestives traduisant
une (?)
- sécrétions exocrines
- insuffisance pancréatique majeure.)
LA PATHOLOGIE DU GÈNE CFTR
* protéine CFTR impliquée dans (?)
- localisé sur chromosome (?)
- La première mutation découverte est une délétion de (?)
- le transport transmembranaire des ions chlores.
- 7
- 3 nucléotides dans
l’exon 10 faisant disparaître le résidu Phe en position 508
Si la mutation déletère est indentifié sur les 2 allèles, comment est le diagnostique?
Direct
3 méthodes de détection effectuée après l’amplification par PCR d’un fragment d’ADN génomique
Méthode ASO
Méthode allèle-spécifique
Méthode des hétéroduplexes
Comment fonctione la méthode des hétéroduplexes?
1) Électrophorétique sur gel
2) Visualisation d’aplimère coloré
3) Analyse:
- Bande unique visisble si individu homozygote pour la mutation
- Bande multiples si individu hétérozygote pour l’allèle
Que signifie la détection de porteur?
La recherche d’un hétérozygotie (porteur sain) chez le patient
Dans un analyse familiale en vue de futur diagnostic prénatal, quel mutation est en priorité des recherches chez le propositus?
F508
Combien de temps prend un diagnostique prénatal pour un trophoblaste homozygote F508-F508.
Quelques heures
Si 2 parents sont porteurs hétérozygotes de F508, comment procédé pour pour savoir si l’enfant sera homozygote?
Diagnostique prénatal du trophoblaste
Qu’est ce que c’est un cas index vivant?
C’est un text d’analyse chimique qui détermine ou non la présence d’une mutation génétique
Est-ce qu’il y a un cas index vivant pour F508?
Non
Est-il difficile d’indentifié la mutation de l’allèle NON-F508?
Oui
(Mêlant, c’est ce que j’en ai sorti si vous voulez lire plus c’est slide #95)
Quelles sortes de mutations cftr sont possible dans les populations?
Tous
Est-ce que les allèles NON-F508 sont diverse?
Oui, cela les rends difficile à rechercher systématiquement les plus de 230 mutations décrites à ce sujet)
À quoi est du les pauci allélismes dans certaines population?
Prédominance de l’effet fondateur
Comme le pauci allélisme devient-il utile dans l’analyse génétique?
Il permet de couvrir une qunatité suffisante de mutations à partir d’un minimum d’allèles.
**La startégie à prendre par contre dépends de la population qui ont plus ou moins d’hétérogénité allélique
Combien d’exons poivent être analysés (contexte de pauci allélisme) afin de couvrir 93% des mutations?
8 exons
CE CHAPITRE A QUAND MÊME BEAUCOUP DE DESSINS, ÇA VAULT LA PEINE DE LES VOIRS ILS NE PEUVENT PAS TOUS ÊTRES TRADUITS EN QUESTION
Keep going :)
2 méthodes de diagnostic indirect
- Via RFLP extragénique
- Via microsatéllites intragéniques
Dans quels cas un diganostique indirect est-il utilisé pour un diganostique prénatal (2 cas)?
- Allèle CF NON-F508 n’as pas pu être mis en évidence
- On dispose pas d’échantillons de ADN cas index
Sur quoi se base la fiabilité des test indirects?
La proximité des marqueurs par rapport aux gènes CFTR (aka les taux de recombianaisons, selon la proximité entre 2 X, à moins de 0,1%)
ET
De leur informativité cumulée (plus de 95%)
Qui suis-je? Maladie pharmacogénétique des muscles squelettiques totalement lié aux produits administrés lors de l’anasthésie générale.
Hyperthermie maligne (HM)
À quoi est est lié la susceptibilitée de HM?
Combien de mutations sur le gène RYR1 ont des influences sur les récepteurs de ryanodine?
Une myopathie transmise sur le mode autosomique dominant.
40+
Combien souvent est-ce que la HM arrive?
1 à 10 cas sur 100 000 anastésies
Une analyse direct peut rechercher quels 3 composantes?
- Les mutations ponctuelles nombreuses
- Les réarrangements majeurs nombreux
- Les mutations ponctuelles communes
Quel est la différence (en %) de fréquences de maladies génétiques chez les chiens vs les humains?
- Jusqu’à 20% chez certaines races de chien (dû à la conservation de traits physiques nuisibles!!)
- Environ 0,01% chez les humains de manière générale
