WB och gelelektrofores Flashcards
vad är elektrofores?
separationsmetod där laddade molekyler vandrar mot en av elektroderna då de placeras i ett elektriskt fält
kvantitativ och kvalitativ analysmetod
vad finns det för kliniska applikationer för elektrofores?
serum/plasma protein elektrofores lipoprotein analys proteinfenotyp bestämning CSV urinanalys proteinkoncentration
vid vilka sjukdomstillstånd kan proteinkoncentration vara av intresse?
cancer, immunsystemstörningar, leverdysfunktion, nedsatt njurfunktion
vad finns i de 5 lika banden vid proteinelektrofores?
- albumin
- alfa1-globulin (HDL, orosomucoid, alfa1-antitrypsin)
- alfa2-globulin (alfa2-macroglobulin, haptoglobulin)
- beta-globulin (transferrin, beta-lipoprotein (LDL))
- gamma-globulin (antikroppar)
hur kan proteiner kvantifieras från banden i gelen?
mha av en densitometer
vad beror vandringen av molekyler i gelen på?
nettoladdning
storlek
struktur
spänning
hur skiljer sig vandringen mellan globulära och fibrösa proteiner?
globulära proteiner är korta och kompakta och kommer därför vandra snabbare än fibrösa proteiner som är långa och smala proteiner
vart kommer laddningen från? vid proteiner
kommer från sura/polära och basiska/polära aminosyror i proteinet
vad finns det för typer av geler?
agaros: oladdad polysackarid-agar
används för separering av DNA, större proteiner
polyakrylamid: längre kedjor, styr storleken på porer
kan urskilja mindre proteiner
vad är SDS-page?
separation av denaturerade proteiner
denaturering med SDS-> primärstruktur-> proteinets laddning blir maskerad
det totala antalet SDS-molekyler bundna till proteinet är proportionellt mot proteinets molekylvikt
vad är det för skillnad mellan continous och discontinous gel?
discontinous: stacking gel (stor porstorlek, pH 6.8) och separationsgel pH 8.8
continous: bara separationsgel
vilka ämnen finns i provprepareringen? vad gör de?
SDS: buffertlösning
DTT: förstör tertiär och kvartärstruktur
glycerol: ökar provsdensiteten
bromofenolblå: hjälper att följa elektroforesen
vad är ohms lag och hur räknas effekt ut? vilken av parametrarna hålls konstant vid elektrofores?
ohms lag: V=I x R
effekt P=I x V= I^2 X R
vid elektrofores så hålls spänningen (V) konstant så att ingen värme utvecklas
vilka faktorer påverkar den elektroforetiska överföringen till membran?
storlek och laddning
pH, viskositet, jonstyrka
spänning
vad finns det för typer av blotting?
tank blotting: sandwich av membran, filterpapper, gel och svamp i ett buffertkärl, lång transfertid
semi-dry blotting: gel och membran som är “sandwiched” mellan 2 filterpapper som är i direktkontakt med elektrodplattor, kort transfertid
vad innebär blockering?
alla icke-ockuperade platser på membranet blockeras
förhindrar ospecifik bindning av ak
ex. bovine serum albumin, non-fat dried milk, PVP, Tween-20
vad finns det för typer av membran?
nitrocellulosa: relativt hög proteinbindningskapacitet, skör
PVDF: hög proteinbindningskapacitet, kan återvändas
hur kan proteiner detekteras?
mha monoklonala ak eller polyklonala ak
primär och sekundär ak, sekundära kan vara fluoroscensinmärkt, isotopinmärkt eller konjugerad med ett enzym
beskriv workflow för gelelektrofores/western blot
testpreparering-> gelelektrofores->transfer->AK-probing->detektion->visualisering->analys
vad är chemiluminescence? enhanced chemiluminescence?
kemisk reaktion där ett kemiskt substrat katalyseras av ett enzym (AP eller HRP) och producerar ett detekterbart ljus som en biprodukt
enhanced: förstärkare, ljusintensitet och durationstid ökar, detekteras med CCD (charged coupled device) kamera eller röntgen
