WB och gelelektrofores

Question 1

vad är elektrofores?

Answer 1

separationsmetod där laddade molekyler vandrar mot en av elektroderna då de placeras i ett elektriskt fält
kvantitativ och kvalitativ analysmetod

Question 2

vad finns det för kliniska applikationer för elektrofores?

Answer 2

serum/plasma protein elektrofores
lipoprotein analys
proteinfenotyp bestämning
CSV
urinanalys
proteinkoncentration

Question 3

vid vilka sjukdomstillstånd kan proteinkoncentration vara av intresse?

Answer 3

cancer, immunsystemstörningar, leverdysfunktion, nedsatt njurfunktion

Question 4

vad finns i de 5 lika banden vid proteinelektrofores?

Answer 4

1. albumin
2. alfa1-globulin (HDL, orosomucoid, alfa1-antitrypsin)
3. alfa2-globulin (alfa2-macroglobulin, haptoglobulin)
4. beta-globulin (transferrin, beta-lipoprotein (LDL))
5. gamma-globulin (antikroppar)

Question 5

hur kan proteiner kvantifieras från banden i gelen?

Answer 5

mha av en densitometer

Question 6

vad beror vandringen av molekyler i gelen på?

Answer 6

nettoladdning
storlek
struktur
spänning

Question 7

hur skiljer sig vandringen mellan globulära och fibrösa proteiner?

Answer 7

globulära proteiner är korta och kompakta och kommer därför vandra snabbare än fibrösa proteiner som är långa och smala proteiner

Question 8

vart kommer laddningen från? vid proteiner

Answer 8

kommer från sura/polära och basiska/polära aminosyror i proteinet

Question 9

vad finns det för typer av geler?

Answer 9

agaros: oladdad polysackarid-agar
används för separering av DNA, större proteiner
polyakrylamid: längre kedjor, styr storleken på porer
kan urskilja mindre proteiner

Question 10

vad är SDS-page?

Answer 10

separation av denaturerade proteiner
denaturering med SDS-> primärstruktur-> proteinets laddning blir maskerad
det totala antalet SDS-molekyler bundna till proteinet är proportionellt mot proteinets molekylvikt

Question 11

vad är det för skillnad mellan continous och discontinous gel?

Answer 11

discontinous: stacking gel (stor porstorlek, pH 6.8) och separationsgel pH 8.8
continous: bara separationsgel

Question 12

vilka ämnen finns i provprepareringen? vad gör de?

Answer 12

SDS: buffertlösning
DTT: förstör tertiär och kvartärstruktur
glycerol: ökar provsdensiteten
bromofenolblå: hjälper att följa elektroforesen

Question 13

vad är ohms lag och hur räknas effekt ut? vilken av parametrarna hålls konstant vid elektrofores?

Answer 13

ohms lag: V=I x R
effekt P=I x V= I^2 X R

vid elektrofores så hålls spänningen (V) konstant så att ingen värme utvecklas

Question 14

vilka faktorer påverkar den elektroforetiska överföringen till membran?

Answer 14

storlek och laddning
pH, viskositet, jonstyrka
spänning

Question 15

vad finns det för typer av blotting?

Answer 15

tank blotting: sandwich av membran, filterpapper, gel och svamp i ett buffertkärl, lång transfertid
semi-dry blotting: gel och membran som är “sandwiched” mellan 2 filterpapper som är i direktkontakt med elektrodplattor, kort transfertid

Question 16

vad innebär blockering?

Answer 16

alla icke-ockuperade platser på membranet blockeras
förhindrar ospecifik bindning av ak
ex. bovine serum albumin, non-fat dried milk, PVP, Tween-20

Question 17

vad finns det för typer av membran?

Answer 17

nitrocellulosa: relativt hög proteinbindningskapacitet, skör
PVDF: hög proteinbindningskapacitet, kan återvändas

Question 18

hur kan proteiner detekteras?

Answer 18

mha monoklonala ak eller polyklonala ak

primär och sekundär ak, sekundära kan vara fluoroscensinmärkt, isotopinmärkt eller konjugerad med ett enzym

Question 19

beskriv workflow för gelelektrofores/western blot

Answer 19

testpreparering-> gelelektrofores->transfer->AK-probing->detektion->visualisering->analys

Question 20

vad är chemiluminescence? enhanced chemiluminescence?

Answer 20

kemisk reaktion där ett kemiskt substrat katalyseras av ett enzym (AP eller HRP) och producerar ett detekterbart ljus som en biprodukt
enhanced: förstärkare, ljusintensitet och durationstid ökar, detekteras med CCD (charged coupled device) kamera eller röntgen