VL 5 Gentechnik III

Question 1

Was ist der Vorteil/ die Besonderheit von –omics Technologien?

Answer 1

Es werden nicht einzelne Gene/Proteine betrachtet, sondern sehr viele auf einmal – Hochdurchsatztechnologien durch Miniaturisierung vorher bereits bestehender Techniken
So kann gleichzeitig ein ganzes Genom betrachtet werden

Question 2

Wie funktioniert ein Microarray? Wozu verwendet man ihn?

Answer 2

Ein Microarray dient der Detektion von genetischem Material bei gleichzeitiger Betrachtung sehr vieler Proben.
Hier wird das Prinzip des Northern-blotting quasi umgekehrt; die Sonden werden auf einer festen Unterlage immobilisiert. Ein Gemisch markierter cDNAs wird dann darauf gegeben und hybridisiert mit entsprechenden Sonden. Nun können die unterschiedlich markierten cDNAs detektiert werden.
Zum Beispiel 25000 Sonden mit Infos zu je einem Gen des menschlichen Genoms; nun kann in einem einzigen Experiment bestimmt werden, welche der 25000 Gene in einem RNA-Gemisch repräsentiert sind.

Question 3

Wie funktioniert Next-Generation Sequencing?

Answer 3

Genomische DNA wird isoliert, in kurze Fragmente zerschnitten und mittels PCR amplifiziert (DNA-Bibliothek). Die Fragmente in der DNA-Bibliothek werden mittels eines Sequenzierers analysiert. Anschließend wird durch bioinformatische Prozesse aus den Millionen von sequenzierten Fragmenten die Genomsequenz rekonstruiert.
Die Amplifizierung erfolgt dabei auf einer festen Unterlage mittels zweier Primer, die vorher an die Fragmente synthetisiert wurden, wodurch es zur Hybridisierung der Primer inklusive Fragment mit den Primern der Unterlage kommt und anschließend zur Brückenamplifikation/ lokalen Clusterbildung.
Die einzelnen Cluster jedes DNA -Fragments werden dann mit einer technischen Erweiterung der Sanger-Sequenzierung analysiert, bei der es nicht zum Kettenabbruch, sondern nur zur vorübergehenden Blockade der Kettenverlängerung und anschließenden Fortsetzung kommt. (Illumina Sequenzierung)
Anwendungen: Genome/Transkriptome sequenzieren, Metagenomics (Tiefseeproben), Mikrobiome (Haut/Darm)

Question 4

Was ist Proteomics? Technik? SILAC?

Answer 4

Mittels LC-MS: Liquid Chromatography – Mass Spectography
Protein wird von Protease zerschnitten/verdaut -> entstandene Peptide werden mittels LC-MS ermittelt. Gibt nur Aufschluss über enthaltene Peptide, nicht jedoch über die Peptidsequenz.
Die Peptidsequenzinformation bekommt man durch eine anschließende MS-Fragmentierung
SILAC = Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture
Dient dem quantitativen Vergleich von Proteinen oder Proteingemischen

Question 5

Wie kann man die Funktionsweise vieler Gene im Genom untersuchen?

Answer 5

1. Enhancer Trap:
   - Enhancer = Kontrollsequenz für die Expression eines Gens
   - P-Element = Transposon (Gensequenz, welche mithilfe einer Transposase ihre Position im Genom zufällig ändern, „springen“ kann)
   - In P-Element wurde lacZ-Gen integriert (codiert für ß-Galaktosidase, setzt bei expression x-gal in blauen Farbstoff um
   - Nun; bei Kreuzung beispielsweise zweier Drosophila, eine mit P-Element, eine mit Transposase, welche Ttransposition dessen induziert hofft man, dass das P-Element in die Nähe eines Enhancers springt
   - Dadurch wird das Gen ausgeschaltet (-> Phänotyp) und das P-Element mit lacZ wird durch Enhancer stattdessen stärker exprimiert (-> Lokalisation des Gens mittels X-Gal Färbung).
   - Bei vielfacher Durchführung erhält man verschiedenste Nullmutanten, die gleichzeitig Funktion und Lokalisation des Gens aufzeigen
   - Nachteil: springt das P-Element in eine essetielles Gen, ist die Funktion schwierig zu studieren, da die Fliege höchstwarscheinlich einfach stirbt.
2. Daher: Gal4 AUS – System: ermöglicht knockout nur in bestimmten Geweben oder zu bestimmten Zeitpunkten