VL 4 Gentechnik II

Question 1

• Wie funktioniert ein Southern/ Northern/ Western Blot? Welchem
  Zweck dient er?

Answer 1

• Southern Blotting: Ziel ist es, ein DNA-Fragment in einem DNA-Gemisch nachzuweisen.
  1. DNA Auftrennung mittels Gelelektrophorese
  2. Dann Übertrag des Ergebnisses vom Gel auf Nitrozellulose, da Gel ungeeignet zur Bearbeitung
  3. Nitrozellulosefilter mit Übertrag zusammen mit radioaktiv markierter Sonde und Puffer in Platikbeutel
  4. Markierte DNA-Fragmente sind dann durch Autoradiogramm sichtbar
• Northern Blotting: Nachweis von RNA nach selbem Prinzip, mittels DNA- oder auch RNA-Sonde
• Western Blotting: Nachweis von Proteinen mithilfe von Antikörpern:
  1. SDS-Page-Gel mit Proteinen
  2. Transfer auf Membran
  3. Inkubation mit primärem Antikörper
  4. Inkubation mit sekundären Antikörpern (mit Markierung)
  5. Detektion (Chemilumineszens o.Ä.)

Question 2

Wie stellt man Antikörper her?

Answer 2

• Antigen wird in Tier injiziert
• Tier produziert Antikörper
• Antikörper können aus Blutserum des Tiers extrahiert werden

Question 3

Epitope Tagging:

Answer 3

Epitope bedeutet in diesem Fall eine bestimmte Abfolge von Aminosäuren (gegen die es käufliche Antikörper gibt)
Dieses Epitope wird in DNA im Vektor geklont, in Zelle eingeführt, exprimiert; heraus kommt Protein mit Epitope Tag, welches sich nun im Western Blot mittels Antikörper detektieren lässt.
Gebräuchliche Epitope: c-myc, HA, 6 x Histidin, Flag, GFP, V5