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AVE I > Virología 4 > Flashcards

Virología 4 Flashcards

1
Q

¿Qué permite el dx viral a nivel de salud pública?

A
  • Mantener bancos de sangre libres de virus
  • Supervisión sobre estrategias de vacunación
  • Identificación de brotes
  • Identificar virus no habituales
  • Identificación de nuevos virus
  • Mantener vigilancia epidemiológica
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2
Q

Dx viral clínico

A

Permite la orientación a través de signos y síntomas para establecer el agente infeccioso que ocasiona el cuadro

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3
Q

Dx viral de laboratorio

A

Permite confirmar la sospecha diagnóstica, pero para esto es necesaria una buena muestra. En ocasiones no es necesario hacer confirmación de laboratorio

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4
Q

¿De qué depende la toma de muestra adecuada?

A

De los aspectos del px y de la situación epidemiológica del momento. Es importante el conocimiento de la estructura y patogenia viral con el fin de determinar la técnica dx y el objetivo de esta

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5
Q

Modelos de infecciones virales asociadas a técnica dx

A
  1. Infecciones agudas: el virus replica activamente, por lo que se pueden detectar componentes virales (cuando ya pasó la enfermedad no se detectan, pero sí se pueden detectar Ac para saber si tuvo la enfermedad)
  2. Persistentes
    - Latente: al detectar genoma no se puede distinguir si está en fase de latencia o replicación (para esto hay técnicas)
    - Crónica: se pueden detectar componentes virales
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6
Q

¿Cómo se obtiene la mejor muestra?

A

La mejor muestra es donde el virus está replicando, es decir, en el órgano blanco

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7
Q

Infecciones asociadas al tipo de muestra

A
  1. Infecciones respiratorias: células de nasofaringe
  2. Infecciones gastrointestinales: deposiciones, biopsia intestinal
  3. Infecciones sistémicas: sangre
  4. Hepatitis: sangre, deposiciones (según el virus)
  5. Exantemas: células basales de lesiones o hisopado nasofaríngeo
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8
Q

¿Cómo se realiza el traslado de muestra?

A
  • Siempre en frío (4°C)
  • Medios de transporte adecuados, manteniendo normas de bioseguridad
  • No conviene congelar y descongelar, porque disminuye la viabilidad del virus y de sus componentes
  • El tiempo máximo en que se puede enviar una muestra al laboratorio depende de la técnica de dx a usar
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9
Q

Infecciones agudas con períodos de incubación cortos

A

La replicación está activa y se pueden reconocer componentes virales (ácidos nucleicos) o antígenos virales.
Ej: Virus Dengue: se detecta primero genoma, luego Ag y luego IgM e IgG

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10
Q

Infecciones agudas con períodos de incubación largos

A

No siempre los síntomas aparecen rápido, entonces al momento de la consulta la cantidad de virus ha disminuido, por lo que las técnicas podrían no detectar los componentes virales. Sin embargo, la respuesta inmune será alta y se puede hacer el dx por IgM o IgG.
Ej: VHA: IgM anti VHA confirma la infección, si solo se detectan IgG significa que ya tuvo la infección

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11
Q

¿Cómo se puede hacer el dx de una infección?

A
  1. Detección directa o indirecta del virus: ácidos nucleicos o Ag viral
  2. Detección de respuesta inmune: IgM
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12
Q

Técnicas de dx virológico

A
  1. Detección del virus:
    - - Agente viral completo: microscopía electrónica, aislamiento viral
    - - Componentes virales: Ag (inmunoanálisis), genoma (métodos moleculares)
  2. Detección de respuesta inmune: anticuerpos (serología)
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13
Q

Dx por microscopía electrónica

A

Se utiliza más en investigación. Se visualiza directamente el agente viral, pero requiere de gran cantidad de partículas para poder verlas (limitada sensibilidad)

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14
Q

Dx por aislamiento viral

A

Se busca si en la muestra hay partículas virales con capacidad infectiva (replicativa). La muestra se traslada, se inocula en células susceptibles y permisivas, luego se espera y verifica si hay un efecto citopático que permita discriminar existencia de replicación viral

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15
Q

Ventajas del aislamiento viral

A
  1. Permite ver si hay un virus viable
  2. En el medio donde se cultiva el virus hay replicación, por lo que se generan más virus para estudios posteriores
  3. Se puede utilizar para el estudio de nuevos virus
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16
Q

Desventajas del aislamiento viral

A
  1. El efecto citopático (ECP) puede demorar y no se puede esperar 1 o 2 semanas para el dx
  2. Pueden haber coinfecciones, las cuales no se pueden discriminar (porque pueden causar ECP similares)
  3. No hay modelo celular para todos los virus
  4. Se requiere de una gran infraestructura de laboratorio
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17
Q

Dx por Ag (inmunoanálisis)

A

Es la forma principal de dx en clínica. Se produce una reacción entre Ag y Ac, y se visualiza dicha interacción.
1. Método directo: se tiene al Ag y a un Ac que se encuentra marcado
2. Método indirecto: se tiene al Ag, un Ac antiviral y un 2do Ac anti-Ac que tiene un marcador
El nombre de la técnica se asocia al método de detección del Ac (radioinmunoanálisis, inmunofluorescencia, ELISA, ELFA)

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18
Q

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

A

A la muestra se le agrega un Ac específico para el Ag viral, y luego se agrega un 2do Ac marcado con fluorocromo. Para visualizar la interacción se debe incidir una luz con un microscopio de fluorescencia. Esta técnica permite hacer vigilancia. Se tiende a usar en panel de virus respiratorios (ya que hay gran excreción de virus): VRS, parainfluenza, influenza A y B, adenovirus (IFI); metapneumovirus (IFD)

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19
Q

Ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA)

A
  1. Técnica de captura/Sandwich: en un pocillo hay Ac anti-Ag de captura, al que se le agrega la muestra. Se agrega un Ac marcado anti-Ag asociado a enzima. Se agrega un sustrato, que por acción enzimática se hará producto, generando un cambio de color
  2. Técnica indirecta: cuando ya se agregó la muestra se agrega un Ac no marcado anti-Ag, y luego un Ac anti-Ac marcado asociado a enzima, después el sustrato
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20
Q

Inmunoensayo: inmunocromatografía (test rápido)

A

A diferencia de los otros análisis que toman 2-4 h, este toma 10-15 min. Detecta Ag. En una membrana de nitrocelulosa se agrega la muestra con un buffer (Ac marcados para el Ag), estos migran y primero se encuentran con Ac de captura, produciendo una señal positiva. Después se encuentran con otro Ac que es control, para verificar el funcionamiento de la reacción

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21
Q

Características del inmunoensayo (inmunocromatografía)

A
  • Es rápido y de bajo costo, pero la sensibilidad es variable según el ensayo e infección
  • Sirve en períodos de alta prevalencia de la infección
  • Es poco sensible (gran cantidad de falsos negativos), pero específico (prácticamente no da falsos positivos)
22
Q

Ensayo rápido VIH: Detección de Ag y Ac

A

Se pueden hacer modificaciones al inmunoensayo para poder detectar Ac además de Ag, que es lo que se hace en VIH

23
Q

Técnicas moleculares para detección de genoma viral

A
  1. Amplificación del blanco: puede ser por amplificación de DNA (PCR) o de RNA (TMA)
  2. Amplificación de la señal: se colocan múltiples señales sobre moléculas blanco
24
Q

Amplificación del blanco según T°

A
  1. Producen cambios de T°: PCR (DNA), tiene muchas variantes (PCR tiempo real, nested PCR, multiple PCR, PCR digital, RT-PCR)
  2. Isotérmicas: amplificación basada en transcripción (RNA), TMA (RNA), NASBA, LAMP (DNA), RT-LAMP (RNA)
25
Q

PCR

A

Permite la amplificación exponencial de una secuencia específica de DNA de una longitud determinada. El producto amplificado se puede detectar fácilmente.

  1. PCR convencional (punto final): es cualitativo. Se detecta mediante electroforesis
  2. PCR en tiempo real: es cualitativo, pero puede hacerse cuantitativo, mediante una señal fluorescente
26
Q

Etapas en el PCR

A
  1. Denaturación (94 - 95°): separación de las 2 hebras de DNA
  2. Apareamiento (45 -65°): los partidores, cebadores o primers hibridan por complementariedad de bases con la muestra de DNA. Le otorga especificidad a la reacción
  3. Elongación (72°): se produce la síntesis de una cadena de DNA desde el partidor en dirección 5’ -> 3’ mediante la enzima DNA Polimerasa

Todo esto se repite durante un número determinado de ciclos

27
Q

Resultados de PCR en tiempo real

A

Puede tener el resultado cualitativo (positivo-negativo) o cuantitativo (n° de copias del genoma). No se puede determinar el n° de copias a no ser que se tenga una curva estándar con n° de copias conocidas.
El mayor o menor n° de copias se ve con el valor de Ct: bajo Ct implica alto número de amplicones (copias); alto Ct implica bajo número de amplicones (copias)

28
Q

Ventajas del PCR en tiempo real

A
  • Rapidez
  • Sensibilidad
  • Especificidad
  • Detección a partir de diversos tipos de muestras
  • Requiere poca cantidad de muestra
29
Q

¿Cuándo se necesita usar PCR en tiempo real cuantitativo?

A
  1. Determinación de virus en replicación activa en la muestra
  2. Monitorización de tto antiviral
30
Q

PCR Digital

A

Permite hacer una cuantificación absoluta. Al extraer el ácido nucleico, la muestra se subdivide en nanopartículas, y en cada una hay una reacción PCR, luego por distintos ensayos se hace una lectura de puntos para cuantificar

31
Q

TMA o TBA

A

Es isotérmica. Consiste en pasar RNA a DNA por una transcriptasa inversa y luego una transcripción in vitro, aumentando la cantidad de RNA, luego se usan técnicas para detectar este RNA

32
Q

RT-LAMP (RT amplificación isotérmica mediada por LOOP)

A

Es isotérmica. Se usan partidores específicos para una zona determinada, y se va amplificando formando LOOPs. El objetivo es que las moléculas se puedan visualizar a simple vista

33
Q

Detección de la respuesta inmune (serología)

A

En la primoinfección aparece IgM, al pasar el tiempo hay un cambio isotípico, generándose IgG. En la 2da infección aumenta rápidamente IgG y en muy pocas oportunidades se detecta IgM. Es decir, si se detecta IgM hablamos de una primoinfección por lo general

34
Q

¿Para qué sirven los métodos serológicos?

A

Para demostrar que en el suero del px existen Ac específicos antivirales. Para determinar una infección reciente se puede:

  1. Detectar IgM específica
  2. Identificar seroconversión (con 2 muestras): de negativo (sin Ac) a positivo (con Ac), o por aumento en el título de Ac 4 veces o más

También sirve para conocer la condición de inmunidad a un virus en particular, mediante IgG específica

35
Q

Métodos serológicos

A
  1. Clásicos: neutralización, inhibición de la hemaglutinación, fijación del complemento
  2. Actuales: ensayos enzimáticos (ELISA), Western blot, aglutinación con látex, inmunocromatografía
36
Q

ELISA para Ac (indirecta)

A
  1. Se tiene previamente un Ag viral de captura
  2. Se agrega suero del px
  3. Se agrega un Ac anti-Ac conjugado con una enzima
  4. Se agrega el sustrato y cambia de color
37
Q

Inmunoensayos quimioluminiscentes

A

Han permitido mejorar los ensayos inmunoabsorbentes, en que en vez de tener una reacción de color, se produce una luz la cual es medida, por lo que son:

  1. Más sensibles que ELISA
  2. Mayor rango dinámico que ELISA
  3. Mayor factibilidad de automatizar
  4. Con reactivos más estables
38
Q

Western blot

A
  1. Se tiene una membrana de nitrocelulosa con proteínas virales previamente fijadas
  2. Se agrega suero del px
  3. Se determina qué tipo de Ac tiene el px
39
Q

¿Cuándo se utiliza el dx por Ac para una infección?

A

Para enfermedades en que el tiempo de incubación es largo

40
Q

Dx molecular: POCT (Point Of Care Testing)

A

Tipo de ensayo automatizado de mucha rapidez que detecta uno o varios virus. Hay varios equipos:

  • ALERE I Influenza A & B: amplificación isotérmica del genoma para detectar influenza A y B en 15 min
  • Cobas-Liat: detecta Influenza A/B, cuenta con todos los reactivos para PCR, en 20 min
  • Xpert Fly Assay: detección cualitativa automatizado para virus como la influenza, realizando PCR en tiempo real, en 75 min
41
Q

Métodos de detección múltiple

A

Útiles cuando se quiere discriminar entre los distintos virus que ofrecen los paneles:

  1. Film Arrays: se pone la muestra en el equipo, se extrae DNA/RNA y se realiza PCR. Detecta múltiples patógenos, se usa en paneles respiratorios o GI de varios virus
  2. Multiplex XMAP: esferas fluorescentes unidas a distintas sondas específicas para detectar un patógeno
42
Q

Variabilidad viral: genotipos

A

Muchos virus tienen variantes genómicas, teniendo impacto a nivel de terapias, circulación, gravedad, etc. Hay varios métodos moleculares para discriminar genotipos:

  1. PCR-RFLP: amplificación y cortes con enzima de restricción
  2. Hibridación con sondas
  3. Secuenciación

Es relevante en resistencia a antivirales, políticas de salud pública y genotipos asociados a gravedad de infección

43
Q

Epidemiología molecular

A

Es relevante establecer determinados genotipos para establecer la circulación de un virus. Ej: en sarampión sirve para saber si el virus adquirido por un individuo fue en Chile o si fue importado

44
Q

Hibridación con sondas

A

Son secuencias nucleotídicas complementarias al genotipo específico:

  1. Se tiene una membrana de nitrocelulosa donde están adheridas las sondas de distintos genotipos que se quieren detectar
  2. Luego de añadir el material amplificado habrá una hibridación, y luego con algún tipo de marca se puede discriminar
45
Q

Ejemplos de hibridación son sondas

A
  • VPH: tiene genotipos de alto riesgo asociados a cáncer y otros de bajo riesgo asociados a patologías benignas, importante diferenciarlos para saber qué medidas tomar
  • VHC: hay 7 genotipos y diversas variantes dentro de cada uno, que difieren en respuesta a terapias y evolución. Detección se hace por secuenciación o amplificación de regiones específicas
46
Q

Monitoreo de VHC

A

Es importante monitorear constantemente el estado del virus:

  1. Ensayos serológicos (detección de IgG):
    - Screening en bancos de sangre
    - Población de riesgo
  2. Detección de RNA
    - Métodos cualitativos (para saber si está infectado o no)
    - Métodos cuantitativos (para establecer carga viral y si responde a tto)
    - Métodos para genotipificar (para establecer el mejor tto)
47
Q

Secuenciación

A

Permite realizar análisis filogenéticos de los genomas. A partir de secuenciaciones y análisis de variantes, se diseñan ensayos diagnósticos basados principalmente en RT-PCR dirigidos a la discriminación de las variantes que circulan. Ej importante de esto es el SARS-CoV-2 para determinar sus variantes

48
Q

Variantes de preocupación (VOI) SARS-CoV-2

A
  1. Aumento de transmisibilidad o cambio perjudicial en epidemiología de COVID-19
  2. Aumento de virulencia o cambio en presentación clínica de la enfermedad
  3. Disminución de la eficacia de medidas sociales y de salud pública o de los medios de dx, vacunas y ttos disponibles
49
Q

Variantes de interés (VOC) SARS-CoV-2

A
  1. Cambios en genoma que se prevé afectan a características del virus como transmisibilidad, gravedad de enfermedad o capacidad para escapar del sistema inmune
  2. Transmisión significativa en medio extrahospitalario o causan varios conglomerados COVID-19 en distintos países, con prevalencia relativa creciente y aumento de casos
50
Q

Variantes bajo vigilancia (VUM) SARS-CoV-2

A
  1. Cualquier variante que presente modificaciones en el genoma que se sospeche puedan afectar a las características del virus y parezcan indicar que la variante puede generar riesgos en el futuro
  2. Mantener el seguimiento y continuar estudiándola hasta que no se disponga de más información

AVE I (9 decks)

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