vecteur et plasmide Flashcards
qu’est-ce qu’un plasmide?
un fragment d’ADN circulaire qui se réprique de façon autonome dans une cellule
qu’est-ce qu’un vecteur de clonage?
un plasmide manipulé génétiquement dans des buts de clonage.
à quoi sert un vecteur de clonage?
à insérer ou cloner un fragment d’ADN exogène
Comment s’appelle la molécule obtenue à la suite d’un insert?
recombinant
Quels sont les 3 caractéristiques que doit posséder un vecteur de clonage?
ori (permet au vecteur de se répliquer de façon autonome = pls copies et répartition aléatoire) gène de sélection (minorité cellules qui acquièrent le plasmide, résistance au antibiotique) sites uniques (site clonage multiple; sites uniques endroit précis)
3 mécanismes d’introduction de l’ADN
transformation (+++), conjugaison, transduction
comment rend E.coli compétente?
présence de solutions salines (sels crée pores dans membrane)
comment détecter les plasmides et s’assurer que chaque cellule en contiennent un?
le mélange est étalée sur gélose nutritive contenant l’antibiotique de sélection. chaque colonie contient 1 plasmide
Qu’est-ce que le concept de compatibilité?
lorsqu’il faut maintenir 2 plasmides dans la même cellule. Il faut qu’il est un ori différent. plus le nbr de copie est grand, moins il y a de chance de perdre un plasmide ou de partition non uniforme
qu’est-ce qui différencie les vecteurs de clonage?
le site de clonage multiple
plasmide pBR322
premier vecteur moderne. ori, gène rop (protéine de contrôle de la réplication en la diminuant) gène amp (résistance ampicilline) gène tet (résistance tetracyclines)
utilisation du plasmde pBR322
inactivation insertionnelle (insert dans gène de résistance = plus la résistance= acquit plasmide)
qu’est-ce que les colonies satellites?
seulement présent lorsque l’ampicilline est utilisée. b-lactamase dégrade ampi et diminue sa concentration, colonie attend et réussie à pousser.
pACYC177 vs pACYC184
177: résistance kanamycine et ampicilline
184: résistance tétracycline et chloramphénicol
différence: site de restrictions pour le clonage
pUC7
amp, ori, tet remplacer par lacZ (b-galactosidase), scm
site de clonage multiple?
région d’ADN ou des sites de restrictions sont situés
différence pUC8-9 et pUC13-14
augmentation du nombre de site de restriction au SCM. entre-eux : inversion du site de clonage multiple par rapport à l’orientation de la transcription du gène LacZa
que permet l’utilisation de la B-gal?
détection par colorimétrie des recombinants (pas besoin de repiquer sur milieux sélectifs)
expliquer le fonctionnement de l’opéron lactose
promoteur, opérateur, trois gène (b-gal). l’expression est contrôlé par le répresseur lacI.
LacI continuellement exprimé, intéragit avec opérateur et empêche transcription. allolactose intéragit avec répresseur et empêche csa liaison avec l’opérateur = synthèse b-gal
allolactase = inducteur naturel
quel est l’inducteur non-naturel pour la b-gal?
IPTG. non métabolisable. production continuelle de B-gal
Qu’est-ce qui donne la couleur avec le b-gal?
indolyl = produit insoluble bleu. Si blanc = recombinant!
Comment détecter un insert dans un gène LacZ?
la B-gal ne sera plus produite et les colonies seront blanches
comment un insert réussit à ne pas empêcher la synthèse d’une B-gal?
insert ne change pas le cadre de lecture
l’insert n’a pas de codon de terminaison dans la phase de lecture
un promoteur a été inséré et l’expression de B-gal se fait a partir de ce promoteur
Comment fait-on pour réguler l’expression de LacZ?
la souche bactérienne devra être LacL ; surexpression du répresseur qui régule l’activité de LacZ
vecteurs dérivés de pUC
gène de résistance, soit : amapicilline, tetracycle, chloramphénicol ou kanamycine. Ori ColE1. Gène LacZa avec SCM dont le nbr et la sorte de site de restriction varient
pSC101
provient salmonella. produit un faible nombre de copie due son plasmide par cellule
