vecteur et plasmide

Question 1

qu’est-ce qu’un plasmide?

Answer 1

un fragment d’ADN circulaire qui se réprique de façon autonome dans une cellule

Question 2

qu’est-ce qu’un vecteur de clonage?

Answer 2

un plasmide manipulé génétiquement dans des buts de clonage.

Question 3

à quoi sert un vecteur de clonage?

Answer 3

à insérer ou cloner un fragment d’ADN exogène

Question 4

Comment s’appelle la molécule obtenue à la suite d’un insert?

Answer 4

recombinant

Question 5

Quels sont les 3 caractéristiques que doit posséder un vecteur de clonage?

Answer 5

ori (permet au vecteur de se répliquer de façon autonome = pls  copies et répartition aléatoire)
gène de sélection (minorité cellules qui acquièrent le plasmide, résistance au antibiotique)
sites uniques (site clonage multiple; sites uniques endroit précis)

Question 6

3 mécanismes d’introduction de l’ADN

Answer 6

transformation (+++), conjugaison, transduction

Question 7

comment rend E.coli compétente?

Answer 7

présence de solutions salines (sels crée pores dans membrane)

Question 8

comment détecter les plasmides et s’assurer que chaque cellule en contiennent un?

Answer 8

le mélange est étalée sur gélose nutritive contenant l’antibiotique de sélection. chaque colonie contient 1 plasmide

Question 9

Qu’est-ce que le concept de compatibilité?

Answer 9

lorsqu’il faut maintenir 2 plasmides dans la même cellule. Il faut qu’il est un ori différent. plus le nbr de copie est grand, moins il y a de chance de perdre un plasmide ou de partition non uniforme

Question 10

qu’est-ce qui différencie les vecteurs de clonage?

Answer 10

le site de clonage multiple

Question 11

plasmide pBR322

Answer 11

premier vecteur moderne. ori, gène rop (protéine de contrôle de la réplication en la diminuant) gène amp (résistance ampicilline) gène tet (résistance tetracyclines)

Question 12

utilisation du plasmde pBR322

Answer 12

inactivation insertionnelle (insert dans gène de résistance = plus la résistance= acquit plasmide)

Question 13

qu’est-ce que les colonies satellites?

Answer 13

seulement présent lorsque l’ampicilline est utilisée. b-lactamase dégrade ampi et diminue sa concentration, colonie attend et réussie à pousser.

Question 14

pACYC177 vs pACYC184

Answer 14

177: résistance kanamycine et ampicilline
184: résistance tétracycline et chloramphénicol
différence: site de restrictions pour le clonage

Question 15

pUC7

Answer 15

amp, ori, tet remplacer par lacZ (b-galactosidase), scm

Question 16

site de clonage multiple?

Answer 16

région d’ADN ou des sites de restrictions sont situés

Question 17

différence pUC8-9 et pUC13-14

Answer 17

augmentation du nombre de site de restriction au SCM. entre-eux : inversion du site de clonage multiple par rapport à l’orientation de la transcription du gène LacZa

Question 18

que permet l’utilisation de la B-gal?

Answer 18

détection par colorimétrie des recombinants (pas besoin de repiquer sur milieux sélectifs)

Question 19

expliquer le fonctionnement de l’opéron lactose

Answer 19

promoteur, opérateur, trois gène (b-gal). l’expression est contrôlé par le répresseur lacI.
LacI continuellement exprimé, intéragit avec opérateur et empêche transcription. allolactose intéragit avec répresseur et empêche csa liaison avec l’opérateur = synthèse b-gal
allolactase = inducteur naturel

Question 20

quel est l’inducteur non-naturel pour la b-gal?

Answer 20

IPTG. non métabolisable. production continuelle de B-gal

Question 21

Qu’est-ce qui donne la couleur avec le b-gal?

Answer 21

indolyl = produit insoluble bleu. Si blanc = recombinant!

Question 22

Comment détecter un insert dans un gène LacZ?

Answer 22

la B-gal ne sera plus produite et les colonies seront blanches

Question 23

comment un insert réussit à ne pas empêcher la synthèse d’une B-gal?

Answer 23

insert ne change pas le cadre de lecture
l’insert n’a pas de codon de terminaison dans la phase de lecture
un promoteur a été inséré et l’expression de B-gal se fait a partir de ce promoteur

Question 24

Comment fait-on pour réguler l’expression de LacZ?

Answer 24

la souche bactérienne devra être LacL ; surexpression du répresseur qui régule l’activité de LacZ

Question 25

vecteurs dérivés de pUC

Answer 25

gène de résistance, soit : amapicilline, tetracycle, chloramphénicol ou kanamycine. Ori ColE1. Gène LacZa avec SCM dont le nbr et la sorte de site de restriction varient

Question 26

pSC101

Answer 26

provient salmonella. produit un faible nombre de copie due son plasmide par cellule