Principe PCR Flashcards
PCR
réaction de polymérisation en chaîne
Quel a été le premier outil d’amplification?
la klenow
qu’est-ce que la PCR?
technique d’amplification in vitro d’ADN avec une ADN polymérase thermostable
quel est le principe de la PCR?
utiliser deux amorces oligonucléotidiques complémentaires à des séquences connues et spécifiques présentes sur chacun des deux brins d’un molécule d’ADN afin d’amplifier la séquence d’ADN ce trouvant entre les deux amorces
Quels sont les étapes de la PCR?
1) dénaturation des amorces et de l’ADN à amplifier
2) renaturation des amorces
3) synthèse d’ADN avec ADN polymérase
Quelle séquence d’ADN est amplifier par la PCR?
Seulement l’ADN entre les deux amorces sera amplifiée,
c’est une amplification sélective
Combien faut-il de cycles pour que les plus longues molécules soient négligeable?
environ 30 cycles = 2^28 fois le produit désiré
Comment détecte-t-on l’ADN amplifiée ?
par electrophorèse sur gel d’agarose et coloration au bromure d’éthidium
Quelle est la particularité des ADN polymérase?
elles proviennent de bactéries thermophiles. Ex: Taq, vent, deep vent, etc…
Pourquoi utilisé de telle polymérase?
parce qu’elle permettent d’utiliser des conditions de stringence élevée qui augmentent la spécificité de la renaturation des amorces avec l’ADN cible
Quel est le désavantage d’utiliser la klenow?
utilisation possible qu’à des conditions peu stringentes qui amène la synthèse d’ADN dont l’homologie avec les amorces est inférieur a 100% (d’ou présence de plusieurs bandes sur gel) amplification non spécifique. Aussi il faut la rajouter à chaque cycle
Pourquoi l’ADN pol thermophile permet un signal d’amplification spécifique?
1- résiste à des température de 95C évitant d’avoir à remettre de l’enzyme à chaque cycle
2- synthétise de l’ADN à 72C, température de stringence élevée qui permet l’obtention d’un signal spécifique
Quel appareil permet la PCR
thermocycleur
Quels sont les 3 étapes d’une PCR type?
dénaturation, renaturation, élongation
en quoi consiste la première dénaturation?
chauffage à température élevée (94/95C) d’une durée d’une minute (30s pour autres cycles) au cours de laquelle l’ADN, digérée par une enzyme de restriction, est alors dénaturée. Les deux oligonucléotides sont déjà présents dans le milieu réactionnel
quelle est la température idéale de dénaturation pour la Taq?
94C pendant 90 secondes. D’autres enzymes sont plus tolérantes. 90 s = s’assure que l’ADN est complètement dénaturer
Tr = ?
Tr = Tm oligonucléotides - 5 (température de renaturation)
Que se passe-t-il durant la renaturation?
les oligonucléotides se renatures avec les séquences homologues de l’ADN cible.
Quoi tu fais si tu obtiens des produits non-spécifiques ?
augmente Tr de 1 à 2C. Normalement, un temps d’élongation de 30 à 60 secondes est suffisant
Que se passe-t-il durant l’élongation?
la polymérase thermophile synthétise l’ADN à 72C à partir de l’amorce jusqu’à la fin de la molécule d’ADN
Quelle est la période de synthèse habituelle?
1 minute à 72C
Quelle est la taille des fragments généralement amplifier?
en dessous de 1 kb
Quels sont les temps d’élongation dépendent de la taille des fragments?
jusqu’à 2000 b = 30-60 secondes
si plus, augmente de 1min par kb
De combien de temps peut-on augmenter une élongation?
jusqu’à 15 minutes si les fragments ont une taille supérieure à plusieurs kb
Qu’advient-il de l’efficacité de la synthèse si la taille des fragments est de plus de 3 kb?
elle diminue drastiquement
L’amplification jusqu’à 35 kb à été réussie
vrai
L’élongation est la seule partie active de la PCR
Faux. durant période de renaturation, il y a une synthèse faible d’ADN. Elle prévient la dénaturation des amorces lorsque la température monte pour atteindre celle de l’élongation
Qu’est-ce que l’élongation finale?
dure plusieurs minutes, c’est la dernière. On s’assure qu’il y ait une synthèse complète de toutes les molécules
Quel est le principe du Hot Start?
variation de la technique de PCR. premier cycle SEULEMENT: ajout tous les réactifs sauf un. incube à la température de dénaturation et ajoute le dernier réactif.
À quoi sert le Hot Start?
permet de diminuer des synthèses résultants d’hybridation non spécifique à la température ambiante
Quoi faire si il y a plus qu’une seule bande visible?
modifications au protocole standard qui ont été développées
