Principe PCR

Question 1

PCR

Answer 1

réaction de polymérisation en chaîne

Question 2

Quel a été le premier outil d’amplification?

Answer 2

la klenow

Question 3

qu’est-ce que la PCR?

Answer 3

technique d’amplification in vitro d’ADN avec une ADN polymérase thermostable

Question 4

quel est le principe de la PCR?

Answer 4

utiliser deux amorces oligonucléotidiques complémentaires à des séquences connues et spécifiques présentes sur chacun des deux brins d’un molécule d’ADN afin d’amplifier la séquence d’ADN ce trouvant entre les deux amorces

Question 5

Quels sont les étapes de la PCR?

Answer 5

1) dénaturation des amorces et de l’ADN à amplifier
2) renaturation des amorces
3) synthèse d’ADN avec ADN polymérase

Question 6

Quelle séquence d’ADN est amplifier par la PCR?

Answer 6

Seulement l’ADN entre les deux amorces sera amplifiée,

c’est une amplification sélective

Question 7

Combien faut-il de cycles pour que les plus longues molécules soient négligeable?

Answer 7

environ 30 cycles = 2^28 fois le produit désiré

Question 8

Comment détecte-t-on l’ADN amplifiée ?

Answer 8

par electrophorèse sur gel d’agarose et coloration au bromure d’éthidium

Question 9

Quelle est la particularité des ADN polymérase?

Answer 9

elles proviennent de bactéries thermophiles. Ex: Taq, vent, deep vent, etc…

Question 10

Pourquoi utilisé de telle polymérase?

Answer 10

parce qu’elle permettent d’utiliser des conditions de stringence élevée qui augmentent la spécificité de la renaturation des amorces avec l’ADN cible

Question 11

Quel est le désavantage d’utiliser la klenow?

Answer 11

utilisation possible qu’à des conditions peu stringentes qui amène la synthèse d’ADN dont l’homologie avec les amorces est inférieur a 100% (d’ou présence de plusieurs bandes sur gel) amplification non spécifique. Aussi il faut la rajouter à chaque cycle

Question 12

Pourquoi l’ADN pol thermophile permet un signal d’amplification spécifique?

Answer 12

1- résiste à des température de 95C évitant d’avoir à remettre de l’enzyme à chaque cycle
2- synthétise de l’ADN à 72C, température de stringence élevée qui permet l’obtention d’un signal spécifique

Question 13

Quel appareil permet la PCR

Answer 13

thermocycleur

Question 14

Quels sont les 3 étapes d’une PCR type?

Answer 14

dénaturation, renaturation, élongation

Question 15

en quoi consiste la première dénaturation?

Answer 15

chauffage à température élevée (94/95C) d’une durée d’une minute (30s pour autres cycles) au cours de laquelle l’ADN, digérée par une enzyme de restriction, est alors dénaturée. Les deux oligonucléotides sont déjà présents dans le milieu réactionnel

Question 16

quelle est la température idéale de dénaturation pour la Taq?

Answer 16

94C pendant 90 secondes. D’autres enzymes sont plus tolérantes. 90 s = s’assure que l’ADN est complètement dénaturer

Question 17

Tr = ?

Answer 17

Tr = Tm oligonucléotides - 5 (température de renaturation)

Question 18

Que se passe-t-il durant la renaturation?

Answer 18

les oligonucléotides se renatures avec les séquences homologues de l’ADN cible.

Question 19

Quoi tu fais si tu obtiens des produits non-spécifiques ?

Answer 19

augmente Tr de 1 à 2C. Normalement, un temps d’élongation de 30 à 60 secondes est suffisant

Question 20

Que se passe-t-il durant l’élongation?

Answer 20

la polymérase thermophile synthétise l’ADN à 72C à partir de l’amorce jusqu’à la fin de la molécule d’ADN

Question 21

Quelle est la période de synthèse habituelle?

Answer 21

1 minute à 72C

Question 22

Quelle est la taille des fragments généralement amplifier?

Answer 22

en dessous de 1 kb

Question 23

Quels sont les temps d’élongation dépendent de la taille des fragments?

Answer 23

jusqu’à 2000 b = 30-60 secondes

si plus, augmente de 1min par kb

Question 24

De combien de temps peut-on augmenter une élongation?

Answer 24

jusqu’à 15 minutes si les fragments ont une taille supérieure à plusieurs kb

Question 25

Qu’advient-il de l’efficacité de la synthèse si la taille des fragments est de plus de 3 kb?

Answer 25

elle diminue drastiquement

Question 26

L’amplification jusqu’à 35 kb à été réussie

Answer 26

vrai

Question 27

L’élongation est la seule partie active de la PCR

Answer 27

Faux. durant période de renaturation, il y a une synthèse faible d’ADN. Elle prévient la dénaturation des amorces lorsque la température monte pour atteindre celle de l’élongation

Question 28

Qu’est-ce que l’élongation finale?

Answer 28

dure plusieurs minutes, c’est la dernière. On s’assure qu’il y ait une synthèse complète de toutes les molécules

Question 29

Quel est le principe du Hot Start?

Answer 29

variation de la technique de PCR. premier cycle SEULEMENT: ajout tous les réactifs sauf un. incube à la température de dénaturation et ajoute le dernier réactif.

Question 30

À quoi sert le Hot Start?

Answer 30

permet de diminuer des synthèses résultants d’hybridation non spécifique à la température ambiante

Question 31

Quoi faire si il y a plus qu’une seule bande visible?

Answer 31

modifications au protocole standard qui ont été développées