TP2 - CITOMETRIA DE FLUXO Flashcards
CITOMETRIA DE FLUXO
- estudo de cels individualizadas
- cels conduzidas num fluxo, uma a uma, em frente a fonte de energia
- analise de particulas e medicao de parametros atraves do citometro
- permite analisar mistura complexo de celulas com marcadores (anticorpos conjugados com fluorocromos que quando excitados emitem luz)
desvios
frontal (forward scatter) FS
- tamanho da celula
lateral (side scatter) SSC
- complexidade e granularidade
fotomultiplicadores
- info sobre comp onda da luz emitida p fluorocromo
componentes essenciais p desenv da citometria de fluxo
CAPACIDADE FLUíDICA
- passar cels uma a uma no fluxo (linha indiana e nao dupletos)
- passar fluxo a alta velocidade
OTICA
- capacidade de analisar dif comp de onda
- desenv de fluorocromos que emitam fluorescencia de forma estavel, brilho e intensidade forte
DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
- p tudo oq queremos estudar
definicao
- tecnica biofisica
- qualitativa (esta ou nao na amostra)
- quantitativa (quanto do alvo está na amostra)
- separacao de particulas numa suspensao monodispersa num meio liquido
caracteristicas
automatizacao
- quer a preparacao quer a analise dos dados
analises multiparametricas
- quanti e quali, grande n de particulas individualizadas
capacidade separativa
- em funcao das caract estabelecidas p analise
- permite obter populacoes puras e viaveis
vantagens
- rapidez
- estudoquanti e quali
- alta sensibilidade (cel c caracteristicas raras pode ser detetada pois elevado numero de celulas sao analisadas quanti e quali)
- multiparametrica (5 a 50 parametros ao mm tempo)
- separacao de subpopulacoes das amostras
- aumento representatividade amostras estudadas e precisao de resultados
- menor tempo gasto
limitacoes
cels tem de estar em suspensao
- n podemos estudar tecidos e sim as cels que estao nos tecidos
- sangue nem sempre representa o que acontece a nivel local
- situacoes que e necessario estudar dupletos
necessidade de controlos
- precisamos de cut off, ou seja, a partir de que intensidade consideramos algo positivo ou negativo
medida da densidade de recetores por citometria de fluxo
- proporcao direta entre intensidade de sinal e antigenios que estamos a esudar
- nivel 1 ( sinal p quando nao ha lfuorescencia) 2 ( maior intensidade. alguns antigenios a superf) 3 ( mais int, mais densidade de antigenios a superf)
- permite medir densiade de recetores a super da celula
citometria de fluxo multiparametrica
- possivel analisar varios parametros num unico tudo em simultaneo
- analise simultanea e de diferentes fluorocromos faz com que p alguns flurocormos haja intensidades de fluoresencia coincidentes, logo aparelho tem de ser compensado e retirar a nterferecia de um quando estudamos o outro
informacao da citometria
- n celulas com expressao de um antigenio alvo (quanti abs e relativa)
- distribuicao de celulas de acordo com densidade de antigenios ( atraves da intensidade de fluoresencia)
- tamanho celular
- (…pg 41)
citometria em imuno
- ident e separacao de cels sanguineas
- diferencia subpopulacoes de linf T
- contagem subpopulacoes t dc4 e cd8
(…pg42)
separacao de cels sanguineas sem fluorocromos
(dos leucocitos)
- atravas dispersao frontal (tamanho) e lateral (complexidade e granulosidade)
linfocitos
- pequenas
- mononucleares e pequena complexidade
monocitos
- tamanho e complexidade ligeriamente maiores (mas pequenos na mesma e continua a ser mononuclear)
granulocitos
- mais tamanho e complexidade
produção de anticorpos monoclonais
- cada tipo de cel B so produz um tipo de anticorpo com especificidade definida
- problema: cels B so produzem um tipo de anticorpo e nao se dividem indefinidamente
- solucao: utilizacao de mieloma (cels neoplasticas)
-
procedimento:
1) imunizar cels de animal (pe, do baco de rato) com antigenio de interesse
2) producao (pelas cels B) de varios anticorpos p aquele antigenio
3) fusao cels B com cels neoplasticas (=hibridoma)
4) processo de selecao das cels de interesse com base nas caract geneticas
5) cultivo da cel de interesse, obtendo muitos hibridomas
6) purificar anticorpos - monoclonais pq sao obtidos a partir de um unico tipo de celula que se dividiu de forma clonal
utilidade cels monoclonais
in vitro
- DIAGNOSTICO (p identificacao de marcadores fenotipicos da superf das celulas)
a) caracterização de cels
b) avaliacao da atividade funcional (recetores de ativacao…)
IN VIVO
- diagnostico
- terapeutica
- (a surgir) teranostica ( fusao diagnostico e terapeutica, conjugando anticorpos com todo o tipo de drogas)
diferenciação cels hematopoiéticas
(marcadores no ipad)
- citometria imp na caracterizacao da diferenciacao
- conhecimento de recetores imp p identificar algumas celulas
- anticorpos conjugados com fluorocromos conseguimos analisar presenca de antigneios
- na citometria usa se combinacoes de fluorocromos p possibilitar analisar mais anticorpos com menos fluorocromos
