P7 - MACS Flashcards
SEPARACAO DE CELULAS
- gradiente de concentracao (P5)
- M.A.C.S. (magnetic activated cell sorting) (recurso a esferas magneticas)
- F.A.C.S (citometro com modulo de separacao e marcando celulas com anticorpos q permitem definir subpopulacao)
MACS
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a) PROCEDIMENTO (aula com separacao de linfocitos B)
1) pipetar amostra de mononucleares p tubo
2) adicionar cocktail de anticorpos e um enhancer
- enhancer (no caso das B) p potencializar ligacao anticorpo-antigenio
3) incubar
- p ligacao dos antigenios aos recetores das cels
4) adicionar esferas que se juntam a ligacao anticorpo-antigénio
- esferas responsaveis p cor acastanhada
5) incubar
6) tampao PBS p diluir cels e aumentar area de exposicao
- cels mt concentradas, sao diluidas p permitir que todas se liguem ao imen
7) iman no tubo
- esferas vao p o iman juntamente com anticorpo e cels com recetores
- cor acastanhada desaparece
8) recolher cels q ficaram em suspensao e colocar novo tubo
- relizamos selecao negativa por isso neste caso as cels que ficaram sao as que no sinteressam
9) colocar novamente iman
- p o caso de alguma esfera nao se ter ligado ao iman
10) diluir cels em suspensao em PBS
11) centrifugar
12) verter sobrenadante, ressuspender em PBS, ficando prontas a serem usadas
**13) testar em citometria, com anticorpos e fluorocromos p ver se temos exclusivamente B
b) 2 formas de separacao de celulas de forma magnetica
SELECAO POSITIVA
- anticorpos com especificidade p a celula q queremos isolar
- restantes celulas sem anticorpos disponiveis
- as cels alvo sao a fracao positiva
- metodo mais puro
- usar quando
1) ligacao do anticorpo a celula alvo nao e um problema
2) nao ha anticorpos disponiveis p cels q nao interessam
SELECAO NEGATIVA (a que usamos)
- anticorpos p todas as cels menos a que queremos separar
- cels alvo sao a fracao negativa
- usar quando
1) queremos que cel a separar fique livre de qualquer marcacao (ligacao do anticorpo pode bloquear ou ativar alguma funcao da celula)
2) ligacao do anticopo bloqueia ou ativa a cel
3) nao existe anticopo p a cel alvo
c) cockatil de anticorpos monoclonais (no procedimento)
- usada na selecao negativa
- dirigido a todas as cels q nao sao linf B e que queremos excluir (restantes mononucleares)
- ficamos com cels B sem qualquer marcacao
- TAC ( tetrameric antibody complex), constituídos p anticorpo com especificada p cel ligado por dois antic ao anticorpo com especificidade p particula metalica (logo as cels marcadas vao p o iman pq estao ligadas a esfera metalica)
d) confirmacao (no caso, de serem B)
- anticorpo anti CD19 ou 20 (em citometria)
se tivessemos feito selecao positivia
- teriamos ocupado um epitopo no antigenio da cel B
- neste caso, como na B temos CD19 e CD20, teriamos de usar um em cada etapa ( um na parte das esferas e outro na parte de confirmacao na citometria)
e) mistura de linfocitos e monocitos e queremos ficar com B, com selecao negativa, que anticorpos estao no cocktail
- queremos tirar todos menos os B logo CD….
(essenciais saber)
3 tira os T
16 E 56 p os NK
14 monocitos
(e tambem…)
15 neutrofilos
123 basofilos e dendriticos**
235 glicoforina (proteina membranar eritrocitos)
f) separacao por selecao negativa a T
- igual ao B (exceto o cd3 obvio)
- CD19 e cd20 p tirar as B
g) obter subpopulacoes a partir de populacoes major
- separamos populacoes major
- com a amostra obtida, continuamos separacoes
- pe, se quisessemos separar cd4 e 8, primeiro separavamos os T e depois primeiro usavamos o anti cd4 e depois o cd8 (se fosse ao mm tempo ficavam todos encostado ao iman)
h) vantagens e desvantagens
- pela separacao magnetica nao da p separar uma celula p expressao de todos os recetores que tem
- quando sao populacoes onde e preciso recorrer a varios marcadores p as caracterizar (pe subpopulacao de Treg) melhor utilizar o FACS (permite marcar logo varias subpopulacoes em simultaneo)
- citometria mais específico
- FACS +demorado e + caro
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