P4- ELISA

Question 1

ELISA

Answer 1

• qualitativa (coloracao mostra se esta ou nao); semi-quantitativa (proporcao de coloracao) e quantitativa (coloração é medida num espetrofotómetro de absorvância e é convertida numa concentração)
• medicao da atividade de uma enzima ligada a um anticorpo
• atividade da enzima proporcional quantidade de antigenio
• direta, indireta, sandwich, competitva

Question 2

a) Direta

Answer 2

(p saber qnt de antigenio)

• placa com pocos
• verter liquido, se tiver antigenios ficam colados no plastico da placa
• lavagem (remover excesso de antigenio)
• adicao anticorpo acoplado a enzima
• qnt mais antigenio, mais anticorpo se liga
• lavagem (remover excesso de anticorpos) (sem esta, luz no final seria correspondente a todos os anticorpos colocados pois mm os q nao se ligaram tem a enzma e iriam contribuir p a cor)
• adicionar substrato (convertido pela enzima num metabolito q ganha cor)
• qnt mais cor, mais enzima, mais anticorpo logo mais antigenio
• curva padrao (cor-quantidade de antigenio)
• vantagens:
  -rapida
  -simples
  -n depende da capacidade do 2º anticorpo

Question 3

b) Indireta

Answer 3

(p saber qntd de anticorpos)

• adionar liquido com antigenios que se colam a placa
• lavagem (remover excesso de antigenios)
• adiconados anticorpos (n ligados a enzimas)
• lavagem (excesso de anticorpo)
• anticorpo secundario, com enzima (que muda a cor), que tem como alvo o 1 anticorpo
• vantagens
  -amplificacao do sinal
  -na direta temos de produzir anticorpo p o antigenio e conjugado com enzima, na indireta temos o anticorpo q reconhece sem nada e o secundario e que tem a enzima (segundo pode ser usado p inumeras elisas p antigenios diferentes)

Question 4

c) Sandwich

Answer 4

• ficar anticorpo a placa (anticorpo de captura)
• lavagem (excesso de anticorpo)
• amostra (caso haja antigenio, fixa se)
• lavagem (excesso de antigenio)
• anticorpo 2 conjugado a enzima
• lavagem
• substrato e cor

(antigenios ou com epitopos iguais e usamos dois anticorpos iguis ou ent temos de usar anticorpos diferentes)

vantagens
- alguns antigenios ligam se mal as placas, sendo por vezes vantajoso ser o anticorpo a ligar
- caso de amostra com inumeros antigenios, sendo o que queremos raro, é vantajoso ter primeiro o anticorpo para esse antigenio raro

desvantagens
- antigenio pode nao ter dois locais de ligacao ou nao termos 2 anticorpos diferentes p epitopos diferentes
- risco de ligacoes inespecificas a mais coisas que o antigenio ou a outos antigenios
- anticorpos podem ligar se um ao outro pelo paratopo (reacao inespecifica) sem antigenio entre eles
-

Question 5

d) competitiva

Answer 5

• kit com reacao completa (anticorpo e antigenio) otimizado p produzir muita cor
• qnt menos cor, mais antigenio
• provedimento
  -incubar anticorpo do kit com amostra
  -se houver antigenio, vai cobrir o anticorpo impossibilitando o de ligar ao antigenio
  -menos quantidade de anticorpo fixa menor, lavamos o anticorpo indisponivel
  -adicionamos anticorpo secundario a amostra, produz menos cor