Tema 4. Observación de microorganismos Flashcards
¿Qué requiere las microbiología para su estudio?
El microscopio
¿Cómo observa el ojo humano los objetos?
Enfocándolos gracias al poder de acumulación del cristalino en la retina. En esta se forma una imagen invertida con respecto al objeto, pero luego, en las vías ópticas y en el centro de visión del cerebro, se le da la vuelta para que veamos el objeto tal cual es
¿Qué es el punto cercano de visión?
Es la distancia mínima a la que el ojo puede enfocar (se ve doble el objeto a partir de ese punto que marca el límite de visión del ojo humano). Puntos más cercanos entre sí de 0,1-0,2 mm no somos capaces de diferenciarlos como separados
¿Existe algún truco para ver objetos más pequeños?
Sí. Colocar una lente convexa, una lupa entre el ojo y el objeto que crea una imagen agrandada del objeto que es la que observamos. Esta sería la base de un microscopio simple ((con una sola lente), con la que podemos aumentar de 5-300 veces el tamaño de un objeto, lo que significa que podremos ver organismos de hasta unas 3 micras aproximadamente
¿Cuál es el diámetro de los microorganismos eucariotas, procariotas y virus?
Eucariotas: ronda las 10 micras
Procariotas: 1-3 micras
Virus: 100 nm, quedan fuera del alcance de estos microscopios simples
¿Cómo funcionan los microscopios compuestos?
Tienen dos lentes: una lente objetivo (cerca del objeto) y otra ocular (cerca de nuestro ojo). La lente objetivo forma una imagen real del objeto entre las dos lentes. La lente ocular está invertida con respecto al objeto. Que sea una imagen real implica que se puede proyectar en una pantalla. Esta imagen se forma en el diafragma de la lente ocular.
A continuación, la lente ocular forma la imagen virtual, mucho más grande, que es la que nuestro ojo ve. Así pues, la persona percibe una imagen del objeto mucho más agrandada e invertida respecto del objeto que observa. Este es el motivo por el cual, cuando miramos a través del microscopio y movemos la platina a la derecha, en realidad se está moviendo hacia la izquierda. Por su parte, cuando la movemos hacia arriba nos da la sensación de que se mueve hacia abajo
¿Cómo se enfoca el objeto?
Acercándolo o alejándolo a la lente objetivo, porque las imágenes tienen que estar en el punto focal de la lente hasta que sea lo suficientemente nítida
¿Cómo se calcula el número de aumentos?
Se multiplican los aumentos de la lente objetivo por los aumentos de la lente ocular. Se emplean lente oculares de 10 aumentos y lentes objetivos de 10 (100x), 40 (400x) o 100 (1.000x). A partir de 1000 aumentos no se consigue ver mejor los detalles de la muestra. Eso implica que podemos ver hasta unos 0,2 micras. En ningún caso con un microscopio óptico se ven microorganismos menores debido al límite de resolución (virus)
¿Estructura de un microscopio óptico?
La lente objetivo se encuentra en el revólver, con el cual podemos cambiar dicha lente girándolo; la platina es el lugar donde se va a colocar la muestra, los tornillos nos permiten mover la platina horizontalmente y verticalmente. Hay una tercera lente que es el condensador y que no participa en la formación de la imagen, sino que se encarga de focalizar la luz hacia la muestra para que esté mejor iluminada y, por lo tanto, se pueda ver mejor. Así mismo, tiene un regulador de la intensidad de la luz, un interruptor y tornillos macrométrico (enfoque más grueso) y micrométrico (mayor ajuste del enfoque), que sirven para enfocar
¿Qué aspectos determinan la calidad de un microscopio?
Los aumentos del microscopio y el poder de resolución
El poder de resolución se define como la capacidad de un sistema óptico de producir imágenes con gran detalle, la capacidad para observar como si estuvieran separados dos puntos que, realmente, están muy juntos. Esta resolución viene dada por la ecuación de Abbe, que mide la distancia más pequeña entre dos puntos más cercanos que se observan como separados
Cuanto mayor sea la resolución de un microscopio, menor será la distancia entre dos puntos adyacentes que se observan como separados (por tanto, mejor distingue entre objetos muy próximos entre sí)
La ecuación de Abbe nos dice que esa resolución es.
- Directamente proporcional a la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto (esto es, la luz que utilice el microscopio)
- Inversamente proporcional a la apertura numérica (AN): cabe destacar que es más importante la AN de la lente objetivo que la de la lente ocular, que se desprecia. Esa apertura numérica depende a su vez de 2 parámetros:
- Eta: el índice de refracción del medio que está entre la muestra y la lente objetivo. Si entre nosotros y la muestra no hay nada, el índice de refracción es el del aire, que es 1 (pequeño). Eso haría que parte de la luz que ilumina el objeto y, por tanto, parte de los detalles de la muestra, escapen del objetivo. Sin embargo, cuando aumentamos el índice de refracción del medio entre la muestra y la lente poniendo por ejemplo alguna sustancia que los toque a ambos a la vez (aceite de inmersión o de cedro, ya que antiguamente se obtenía del cedro), conseguimos que los detalles de la misma no escapen de la lente, sino que se concentren y, por tanto, aumente el poder de resolución. Dicho aceite es una sustancia transparente, lo que es ideal para que no distorsione, con un índice de refracción muy similar al vidrio Chrome ((vidrio con el que se fabrican las lentes, 1,53)). En resumen: para disminuir la distancia nos interesa que el denominador sea lo más grande posible y que eta sea lo más grande posible
Sen theta: es la mitad del ángulo que hay entre la muestra y la lente objetivo. La lente objetivo es una lente que funciona a una distancia de la muestra muy grande, lo que hace que este ángulo theta sea pequeño. No obstante, para que la apertura numérica de la lente objetivo sea lo más óptima posible, el denominador debe ser lo más grande posible para que la distancia sea lo más pequeña posible. El seno máximo que existe es 1, que es el seno de 90º, así que tendríamos que conseguir una lente objetivo que funcione lo más pegada posible a la muestra
El aceite de inmersión solo se puede usar con objetivos de 100 aumentos
¿Qué son realmente la lente ocular y objetivo?
No son única lente, sino que están formadas por muchas lentes porque así se consiguen disminuir mucho las aberraciones estéricas y cromáticas. Si usásemos una sola lente esta tendría que ser una perfecta. No obstante, a pesar de estar formado por muchas lentes, el efecto óptico es el de una única lente
¿Cómo podemos observar los microorganismos en un microscopio de campo claro?
Podemos hacer una preparación en fresco. Cogemos una solución de agua o isotónica, resuspendemos un poco de masa microbiana en un portaobjetos, le ponemos un cubre encima y procedemos a la observación al microscopio (echando aceite de inmersión sobre el cubreobjetos). No obstante, la calidad de la imagen no solamente depende de los aumentos, sino también del contraste, por lo que si yo hago eso directamente no voy a observar prácticamente nada, sino que solamente se verán bien los microorganismos que tienen pigmentos naturales. Este poco contraste se debe a que el índice de refracción de las células es similar al medio acuoso donde ponemos los microorganismos. Por ello, no es apta para ver la mayoría de microorganismos, pero sí es útil para aquellos con pigmentación, así como para observar la movilidad en bacterias y hacer exámenes en heces de protozoos y diversos parásitos. Para solucionar este contraste tan pobre se han encontrado dos soluciones:
- Usar tinciones, tiñendo a las células con colorantes
- Usar microscopios ópticos modificados (microscopio de contraste de fases, de campo oscuro, de fluorescencia…)
¿Cuál es el objetivo de las tinciones?
Aumentar el contraste entre las células y el fondo usando un microscopio de campo claro. Además, permite preservar la muestra para estudios posteriores. Tienen valor diagnóstico y taxonómico porque nos aportan información sobre características de los microorganismos.
¿Qué son los colorantes?
Son compuestos orgánicos que tienen color gracias a la presencia de grupos químicos denominados cromóforos, anillos aromáticos con dobles enlaces conjugados. Sirven para realizar las tinciones
¿Qué tipos de colorantes hay?
- Básicos o catiónicos (con carga positiva, se unen a las superficies negativas de la célula), como el azul de metileno, el cristal violeta, la safranina, la fucsina, el verde malaquita…
- Colorantes ácidos o aniónicos (carga negativa, se unen a las superficies positivas de la célula), sirven para teñir estructuras específicas. Nigrosina, rojo congo, eosina, fucsina ácida…
- Los colorantes liposolubles, sirven para teñir determinadas estructuras. Negro sudán, para teñir lípidos selectivamente
Una cosa a tener en cuenta es que las células microbianas tienen generalmente en su superficie carga negativa, por lo que se suelen emplear colorantes básicos
¿Qué son los mordientes?
Son compuestos químicos o tratamientos adicionales a los colorantes, que se usan en las tinciones, con el fin de acentuar la unión del colorante a las estructuras celulares para fijar bien esa tinción. Podemos emplear distintos tratamientos como el calor, o bien compuestos químicos como el fenol (en la tinción de Ziehl-Nelsen con fucsina fenicada; cuando vemos en un colorante el apellido fenicado es que contiene fenol), el lugol (en la tinción de Gram actúa como mordiente), el ácido tánico para la tinción de flagelos…
Son diversos los compuestos que pueden actuar como mordientes
¿Cuál es la tinción más común?
La tinción simple, es una tinción de los grupos catiónicos
¿Cómo se lleva a cabo una tinción simple?
El proceso inicial es la realización del frotis, con 3 etapas:
- Extensión de la muestra para que quede una capa muy fina sobre el portaobjetos, lo que nos permitirá posteriormente ser capaces de visualizar células aisladas
- Secado al aire de la muestra
- Fijación que se puede realizar con compuestos químicos (se realiza sobre todo en microscopía electrónica), mientras que en microscopía óptica se hace fijación a la llama (con el calor de la llama). Normalmente,. si realizas fijación a la llama, la etapa de secado al aire se omite porque al mismo tiempo que vas fijando la muestra, se va secando. Así, los objetivos que tiene la fijación con calor son:
- Coagulación de proteínas para pegar la muestra
- Inactivación de enzimas y proteínas para detener el metabolismo celular (las tinciones las queremos para guardarlas por lo que tienes que detener el metabolismo microbiano por completo)
- Inactivación de los microorganismos
- Adherir las células a la superficie del portaobjetos porque, a continuación, vamos a añadir colorantes y, si estas células no están fijadas, cuando se eche el colorante estas se escurrirán por completo
- Desecar estructuras celulares que se endurecen para que no se alteren
- Existe otro tipo de fijación química, realizada en microscopía electrónica, como puede ser con formaldehído y glutaraldehído, cuyo fin es la preservación de estructuras intracelulares
Tras la fijación procedemos a añadir el colorante, que puede ser cualquier colorante catiónico. Tras ello, cubrimos bien la muestra con el colorante y esperamos un minutos para que ese colorante se fije bien, lo lavamos con agua destilada, lo secamos presionando ligeramente sobre el papel de filtro/secante pero sin restregar y visualizamos con el microscopio de 100 aumentos y aceite de inmersión. Cabe destacar que la cara con la que se ha hecho el frotis tiene que estar hacia arriba pegando con la lente objetivo.
Esta tinción simple nos proporciona todo tipo de información: tamaño, forma y disposición de las células
¿Qué otros tipos de tinciones tenemos?
- Las tinciones simples: tiñen la célula con un solo color (el del colorante que hemos usado). Seremos capaces de visualizar la morfología de las células y si están agrupadas entre sí con algún patrón o no
- Las tinciones diferenciales: permiten agrupar los microorganismos según determinadas características. Entre ellas, la más famosa es la tinción de Gram (permite clasificar bacterias en gram + o gram -) o la de Ziehl-Nelsen o ácido-alcohol resistentes (rojo) o no resistentes (azul)
- Las tinciones estructurales nos permiten observar diferentes estructuras microbianas, como por ejemplo la tinción de cápsulas (la cápsula es un material de origen polisacarídico o proteíco que envuelve las células). Para ello, lo que hacemos es añadir a la tinción tinta china, y como la cápsula es hidrófoba, la repele y se ve el fondo oscuro (es una tinción negativa al teñir el fondo) y las cápsulas que envuelven a las células. También es una tinción estructural la tinción de Wirtz de endosporas, donde las endosporas se muestran verdes y las células vegetativas rosas; o la tinción de flagelos (estructuras motoras de las células motoras de unos 20 nm de espesor) que, en realidad, no son visibles al microscopio debido a sus finísimas estructuras, pero con el procedimiento engroso al flagelo.
¿Qué es la tinción de Gram?
Es una de las tinciones diferenciales más importantes en Microbiología, la cual fue ideada por Gram, quien murió sin saber por qué se teñían las células de forma diferente. Esta duda no se resolvió hasta que se desarrolló el microscopio electrónico y se pudo ver la composición de la pared, la cual constituye la base de la tinción de bacterias Gram+ y Gram-. Es muy importante en diagnóstico (si vemos diplococos Gram - en una muestra de líquido espinal, prácticamente es diagnóstico de Neisseria meningitidis, agente causal de la meningitis)
¿Cuál es el procedimiento de la tinción de Gram?
- En esta tinción lo que se hace es preparar el frotis y, a continuación, se aplica el colorante principal que es el cristal violeta (colorante primario). Este es un colorante catiónico que tiñe todas las células, Gram+ y Gram-, lo cual hace que todo se tiña de este color morado. Esperamos 5 minutos
- La siguiente etapa aplicación de lugol, una mezcla de yodo y yoduro potásico, que actúa como mordiente, acentuando la unión del cristal violeta a la célula. Esperemos 1 minuto y lavamos con agua destilada
- La etapa más importante o clave es la decoloración con alcohol (a veces también se usa acetona). En esta etapa se va añadiendo alcohol gota a gota que permite eliminar el cristal violeta de las células Gram-. pero no de las Gram+, que siguen teñidas de violeta. Lavamos con agua destilada
- Finalmente se aplica el colorante de contraste que es la safranina. Este también es un colorante catiónico, por lo que tiñe las células con carga negativa, pero las cargas negativas de las Gram+ ya están ocupadas por el cristal violeta, por lo que solamente se tiñen las Gram- de color rosa que han sido lavadas previamente con el alcohol
Las células Gram+ se ven violetas y las Gram- de color rosa
¿Qué diferencia hay entre la pared celular de las bacterias Gram+ y Gram-?
En las Gram+, hay una gruesa capa de peptidoglucano. Tiene muchas cargas negativas y hace que cuando se pegue el cristal violeta, acentuado con la tinción de lugol, ya no se pueda quitar, por mucho alcohol que se añada
En las Gram-, hay una capa muy fina de peptidoglucano, y un espacio periplásmico que separa la membrana plasmática de otra externa, y finalmente una membrana externa parecida a la membrana plasmática. En este tipo de paredes, cuando añadimos el alcohol, sí se lava fácilmente el cristal violeta, aunque añadamos previamente lugol
¿Qué es la microscopía de campo oscuro?
Entre la fuente de luz y la lente del condensador introducimos un diafragma, de manera que la luz que llega al condensador no es un cilindro de luz completo, sino que existe un diafragma que hace que solo llegue al condensador un anillo de luz, oscuro en el centro. Esta luz, cuando llega al condensador, se refracta, de forma que cuando llega a la muestra, si no hay una célula los rayos no entran en la lente objetivo, sino que forman un cono de luz y el objetivo queda en el centro oscuro. Se ven las células brillantes sobre el fondo oscuro
Se consigue aumentar hasta unas 10 veces el poder de resolución respecto al microscopio tradicional, llegando hasta 20 nm, lo que permite visualizar algunas células bacterianas o microorganismos muy delgados que no se pueden ver con el de campo claro, como flagelos y espiroquetas (unas estructuras en espiral que son patógenos humanos como Treponema pallidum (sífilis), Borrellia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Leptospira (leptospirosis)…) Por tanto, se usa en diagnóstico. Para ello se hace un examen en fresco del exudado de una lesión o de la sangre. Cabe destacar que no es necesario teñir y que se pueden ver los microorganismos vivos (en movimiento)
¿Qué es la microscopía de contraste de fases?
Es capaz de transformar pequeñas diferencias en los índices de refracción de los componentes celulares mediante retardos en la fase de la luz para que tengan distintas intensidades lumínicas
Entre la fuente de luz y la muestra se introduce un diafragma anular, al cual llega la luz procedente de la fuente de la parte de abajo. Posteriormente, esa luz llega al condensador, el cual es algo diferente. Este hace que cuando la luz no atraviese en la muestra ningún componente en el medio acuoso (esto es, el índice de refracción celular es menor que el del medio), todos los rayos de luz que entren en el condensador vayan a parar a un nuevo componente llamado la placa de fase, concretamente a un sitio de dicha capa denominado anillo de fase. Este es un componente circular de cristal especial y diferente en las zonas blancas que en el propio anillo de fase. Así, todos los rayos sufrirán un retardo de 1/4 de longitud de onda
Por el contrario, si en la muestra hay componentes con índice de refracción mayor que el del medio, los rayos al atravesar la placa de fase lo harán por un sitio diferente al anillo de fase (en la zona central o periférica), por lo que se adelantarán entre 0 y 1/4 de longitud de onda (por tanto, siempre será menos de 1/4)
Se puede aumentar la diferencia en la intensidad del contraste adelantando lo que no atraviesa la muestra y retardando lo que la atraviesa
No necesita tinción
Hay una modificación de esta microscopía de contraste de fases llamada DIC (microscopía de contraste diferencial), en la cual la placa de fase, en lugar de ser materiales ópticamente diferentes, usaría prismas y se observarían como imágenes en 3D
