Tema 3. Nutrición y cultivo de microorganismos Flashcards
1
Q
¿Qué hay que añadir para cultivar microorganismos?
A
Nutrientes
2
Q
¿Qué son los nutrientes?
A
Son los compuestos químicos que las células emplean en la biosínteis y/o en la obtención de energía en el metabolismo celular para asegurar el mantenimiento de dicha célula
3
Q
¿La composición de la célula es su mayoría qué molécula?
A
H20
4
Q
¿Qué constituye el agua?
A
El medio en el que se encuentran disueltos todos los componentes de la célula y donde se llevan a cabo las reacciones químicas
5
Q
¿Qué son los macronutrientes?
A
Son los nutrientes necesarios para cualquier célula, por lo que si queremos cultivar cualquier microorganismo tendremos que proporcionarles estos macronutrientes forzosamente
6
Q
¿Cuáles son los macronutrientes?
A
C, O, H, N, P, S
7
Q
¿Qué son los macronutrientes minoritarios?
A
Son nutrientes que se consideran macronutrientes dependiendo del microorganismos en cuestión
8
Q
¿Cuáles son los macronutrientes minoritarios?
A
K, Mg, Ca, Fe y Na
9
Q
¿Qué peculiaridad presenta el Na?
A
Depende mucho del hábitat del microorganismo: en organismos marinos es muy necesario, en terrestres puede ser considerado un micronutriente
10
Q
¿Qué son los micronutrientes?
A
Son nutrientes que la célula necesita pero en una cantidad bastante menor.
11
Q
¿Cuáles son los micronutrientes?
A
Mn, Cu, Ni, Zn, Co, Mo…
12
Q
¿Qué son los factores de crecimiento?
A
Son compuestos que el microorganismo necesita o no en función de su metabolismo, de si es capaz de sintetizarlo o no
13
Q
¿Qué más hay que tener en cuenta en el cultivo de microorganismos a parte de los nutrientes?
A
Las condiciones o factores ambientales: temperatura, pH, O2, CO2, luz, disponibilidad de agua, presión hidrostática…
14
Q
¿Qué es el carbono?
A
Es el macronutriente por excelencia por ser el constituyente principal de las biomoléculas
15
Q
¿Qué son los microorganismos heterótrofos?
A
Los que toman la fuente de C de compuestos orgánicos del medio ambiente
16
Q
¿Qué son los microorganismos autótrofos?
A
Los que toman la fuente de C de la fijación de CO2 atmosférico
17
Q
¿Cómo podemos suministrar carbono a los medios de cultivo?
A
En forma de compuesto orgánico (glucosa, acetato, aminoácido…) o en forma de mezclas complejas (caldos de carne, hidrolizados de proteína…)
18
Q
¿Cómo se suelen tomar el H y el O?
A
Del agua en el que vienen disueltos los otros compuestos o añadiendo directamente agua al medio de cultivo, siempre teniendo en cuenta los requerimientos de oxígeno
19
Q
¿Cómo se suministra el N a los medios de cultivo?
A
En forma inorgánica (sales de amonio, nitratos, nitritos, N2 atm…) u orgánica
20
Q
¿Qué microorganismos pueden llevar a cabo la fijación de N2 atm?
A
Los procariotas
21
Q
¿Cómo se proporciona el P?
A
Como fosfato
22
Q
¿Y si el P se encuentra en moléculas fosforiladas?
A
Se debe escindir el fosfato de la molécula en el medio externo, antes de que las células externas lo capten
23
Q
¿Cómo se aporta el S?
A
En formas inorgánicas (sulfuro, sulfato, sulfito…) u orgánicas (aas, compuestos orgánicos sulfurados…)
24
Q
¿Cómo se aportan los macronutrientes minoritarios?
A
Los microorganismos los toman en forma de sales. Son importantes para las células al ser cofactores de enzimas o intervenir en la estabilidad de membranas y paredes celulares…
25
¿Cómo se aportan los micronutrientes?
No hay que aportarlos específicamente a los medios de cultivo, ya que con los elementos carga que tiene disuelto el agua u otros componentes es suficiente para satisfacer los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se cultivan en los laboratorios
26
¿Qué compuestos pueden actuar como factores de crecimiento?
Vitaminos, aas, bases nitrogenadas (purínicas y pirimidínicas) que son necesarios para en el metabolismo microbiano, por lo que tenemos que aportarlos nosotros a los medios de cultivo
27
¿Cómo se denominan los microorganismos que necesitan algún factor de crecimiento?
Auxótrofos (para dicho(s) factor(es) de crecimiento)
28
¿Cómo se denominan los microorganismos que requieren muchos factores de crecimiento?
Fastidiosos, ya que suelen caros e inestables (por ejemplo, las bacterias del ácido láctico)
29
¿Cómo se denominan los microorganismos que no requieren factores de crecimiento?
Protótrofos (para dicho(s) factor(es) de crecimiento)
30
¿Cómo se indica si un microorganismo es protótrofo o auxótrofo para un compuesto x?
Protótrofo: x(+)
Auxótrofo: x(-)
31
¿Cuáles son los 5 tipos de nutrición microbiana?
1. Quimioautótrofa: fuente de carbono (CO2) fuente de energía (compuestos inorgánicos reducidos)
2. Fotoautótrofa: fuente de carbono (CO2) fuente de energía (luz solar)
3. Quimioheterótrofa: fuente de carbono (compuestos orgánicos) fuentede energía (compuestos inorgánicos reducidos)
4. Fotoheterótrofa: fuente de carbono (compuestos orgánicos) fuente de energía (luz solar)
5. Mixótrofa: fuente de carbono (compuestos orgánicos) fuente de energía (compuestos inorgánicos)
32
¿Qué son los medios de cultivo?
Son preparaciones que pueden estar en estado sólido, líquido o semisólido y poseen los nutrientes necesarios para que puedan crecer los microorganismos
33
¿Para qué se usan los medios de cultivo?
Para crecimiento de microorganismos, transporte y almacén de microorganismos, selección de microorganismos y revelación de características metabólica
34
¿Cuáles son los componentes principales de los medios de cultivo?
Agua, nutrientes, colorantes, indicadores de pH, agentes solidificantes (en medios sólidos) y sistemas tampón de pH
35
¿Cuál es la función del agua en los medios de cultivo?
Es el disolvente de los nutrientes que vamos a añadir a los medios de cultivo. Se usa agua destilada porque carece de Ca y Mg, metales que precipitarían con los fosfatos dando lugar a un enturbiamiento del medio de cultivo
36
¿Cuál es la función de los colorantes?
Revelar alguna característica metabólica del microorganismo
37
¿Cuál es la función del indicador de pH?
Revelar alguna carcteristica metabólica o bioquímica del microorganismo, y el color del medio varía en función de su hay variación de pH
38
¿Cuál es la función del sistema tampón de pH?
Lo suelen llevar casi todos los medios de cultivo, porque, como consecuencia del crecimiento microbiano, hay productos de desecho que harían que variara el pH del medio muy rápidamente impidiendo que los microorganismos siguieran creciendo
39
¿Qué es el factor limitante? ¿Y el nutriente limitante?
Es el componente del medio de cultivo que antes se agota cuando inoculamos el microorganismo y hay crecimiento. Por lo tanto, llamamos nutriente limitante a aquel nutriente del medio que antes se agota. Así, los microorganismos no crecen indefinidamente, sino hasta que el nutriente limitante se agota
40
¿Cómo se prepara un medio de cultivo?
1. Al agua se le añaden los nutrientes
2. Se ajusta el pH tras añadir dichos nutrientes
3. A los medios líquidos, tras ajustar el pH, se les añade el agente solidificante
4. Se prepara independientemente sustancias que precipitan o que reaccionan entre sí. Por ejemplo, si hay que añadir P y por otra parte Ca y Mg, el P se prepara aparte y solo lo añadiremos al medio justo antes de inocular los microorganismos
5. En medios sólidos se calienta la preparación para disolver el agente solidificante y distribuir en tubos antes de que se solidifique
6. Se esteriliza el medio (en el autoclave), salvo los componentes que reaccionen por calor con otros (hay que autoclavarlos por separado)
7. En caso de que sea necesario, se añaden sustancias termolábiles que no se han podido esterilizar en el autoclave y que normalmente se esterilizan por filtración
8. El medio de cultivo se distribuye en placas Petri, tubos o erlenmeyer, dependiendo del medio de cultivo
41
¿De qué tres formas podemos clasificar los medios de cultivo?
Según su composición química, según su estado y según su finalidad o uso
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¿Cómo podemos clasificar los medios de cultivo en base a su composición química?
En medios definidos y medio complejos
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¿Qué son los medios definidos?
Los medios definidos/sintéticos/mínimos/minerales son aquellos en los que conocemos la composición exacta tanto cuantitativa como cualitativamente a nivel molecular.
44
Ejemplo de medio definido
Medio M9
45
¿Qué son los medios complejos?
Los medios complejos poseen compuestos que están formados por mezclas complejas de compuestos, como las peptonas, el almidón, el extracto de carne, el extracto de levadura...
46
¿Qué es la peptona?
Es un hidrolizado de proteínas que puede hacerse con proteínas de la carne o con gelatina (proteína animal) o bien a partir de caseína (proteína de la leche)
47
Ejemplo de medio complejo
Medio LB (Luria-Bertani)
48
¿Cómo podemos clasificar a los medios de cultivo según su estado físico?
En medios líquidos, sólidos y semisólidos
49
¿Qué son los medios líquidos?
También llamados caldos, no contienen agente solidificante
50
¿Qué son los medios semisólidos?
Se le añade agar-agar a una concentración menos del 1%, normalmente al 0,5%
51
¿Qué son los medios sólidos?
Se les añade agar-agar a una concentración igual o superior del 1%, del 1,3% al 1,5%
52
¿Cuál, qué y porqué es el agente solidificante usado por excelencia?
El agar-agar. Es un polímero sulfatado procedente de algas rojas cuyo uso convertiría el medio en complejo al tratarse de un polímero complejo. Pero la presencia de agar-agar en un medio no se tiene en cuenta a la hora de definir un medio en complejo o definido, porque los microorganismos no lo usan.
53
¿Hay alternativas al agar-agar?
El gel de sílice, pero es caro y solo se usa en bacterias autótrofas estrictas que no toleran la presencia de compuestos orgánicos en el medio de cultivo
54
¿De qué formas se puede disponer el medio de cultivo?
Los medios semisólidos o sólidos se pueden disponer en Placas Petri. Los medios líquidos en tubos o Erlenmeyer.
55
¿Qué asa de siembra se usa para cada medio de cultivo?
Para medios líquidos: asa de Kolle
Para medios semisólidos: asa de picadura´
Para medios sólidos: asa de Drigalsky
56
¿Cómo podemos clasificar a los medios de cultivo en base a su finalidad o uso?
Medios comunes, medios enriquecidos, selectivos, diferenciales, medios de transporte y cultivos celulares
57
¿Qué son los medios comunes? Ejemplo
Sus nutrientes permiten el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos que no tienen exigencias nutricionales. Agua de peptona
58
¿Qué son los medios enriquecidos? Ejemplo
Se favorece el crecimiento de un grupo microbiano específico al añadir o eliminar un componente necesario para los mismos. Agar chocolate
59
¿Qué es el agar sangre?
Es un medio de cultivo enriquecido con sangre o hemoglobina utilizado para el aislamiento de una amplia variedad de microorganismos. Constituye un medio diferencial, puesto que permite estudiar reacciones hemolíticas de patógenos (como Streptococcus)
60
¿Cómo podemos aislar microorganismos fijadores de N2 atmosférico, que usan como fuente de N?
Diseñamos un medio de cultivo definido que contenga todos los nutrientes necesarios salvo el N, de forma que cuando sembremos ahí una muestra ambiental solamente crecerán los microorganismos que sean capaces de usar el N del aire, mientras que el resto de microorganismos no crecerán
61
¿Cómo podemos aislar del medio ambiente un microorganismo que posee celulasas?
Las celulasas son enzimas capaces de degradar la celulosa. Diseñaremos un medio de cultivo cuya fuente de carbono principal sea la celulosa, de forma que solo los microorganismos productores de celulasas van a ser capaces de degradar dicha celulosa y usarla como fuente de Carbono, mientras que los demás microorganismos que no posean celulasas no crecerán porque carecerán de los nutrientes para ello
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¿Qué son los medios selectivos? Ejemplos
Son medios que contienen una determinada sustancia que inhibe el crecimiento de algunos microorganismos y permitiendo a su vez el crecimiento de otros que son resistentes a dicho agente. Antibióticos, agar McConkey (en cuya composición intervienen las sales biliares, que inhiben el crecimiento de casi todos los microorganismos excepto las enterobacterias, que están adaptadas por su hábitat natural, el intestino).... El cristal violeta o el telurito potásico inhiben el crecimiento de todos los microorganismos salvo el Corynebacterium
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¿Qué son los medios diferenciales?
Permiten distinguir alguna característica o actividad metabólica/bioquímica del microorganismo. Generalmente este tipo de medios contiene un indicador de pH que revelará si el microorganismo estará usando una fuente de C o no. Ejemplos de esto se ven en el aparato digestivo, donde durante el metabolismo de los azúcares se generan compuestos ácidos, por lo que usando un indicador de pH cambiará el color del medio
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¿Qué es el agar TCBS?
Su nombre de las iniciales de algunos componentes como Tiosulfato, Citrato sódico y de hierro, Sales Biliares, Sacarosa... El tiosulfato y el hierro permitirán detectar la producción de ácido sulfhídrico puesto que este procede de usa el tiosulfato como aceptor final en las cadenas de transporte de electrones en una respiración anaerobia, de forma que ese sulfhídrico reaccionará con el hierro generando un precipitado negro de sulfuro de hierro perfectamente visible. Esto hará que el medio se considere diferencial, pues nos permite revelar los microorganismos capaces de usar el tiosulfato. Por otra parte, es también diferencial porque el medio tiene un indicador de pH, el azul de timol y bromotimol, que vira a color verde en aquellos microorganismos que no son capaces de usar la sacarosa mientras que si la usan (sacarosa+) y generan compuestos ácidos vira a amarillo. Además, la presencia de las sales biliares y del cloruro sódico en altas concentraciones hace que el medio sea también selectivo. Así mismo, se consideraría complejo por la presencia de peptona, triptona o extracto de levadura. Este medio permite diferenciar especies de Vibrio en muestras contaminadas de agua, heces o alimentos y que producen una patología que aparentemente es parecida pero cuyos tratamientos son distintos. Se trata de un medio sólido (agar). No obstante, puede pasar a ser caldo TCBS simplemente retirando el agar de la receta
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¿Qué es el agar-McConkey?
Es un medio selectivo ya que contiene sales biliares y cristal violeta, compuestos que impiden el crecimiento de todas las bacterias gram+ y gram- que no sean enterobacterias. Es un medio complejo porque presenta peptonas y sales biliares. Es diferencial porque contiene un indicador de pH que es el rojo neutro, que nos revela si el microorganismo fermenta o no la lactosa que contiene el medio. Si la fermenta (coliformes+) se ven de color rojo intenso, pues vira a pH ácido. Si no la fermentan (coliformes-) se ven de color amarillo, ya que no viran a pH ácido, sino que este se queda neutro o básico. Es un medio sólido, ya que presenta más de 10g agar/L. Por tanto, tanto los coliformes como los no coliformes crecerán al ser ambos enterobacterias pero, en función del pH y el color que resulte, podremos diferenciar un tipo de otro. Este medio podría ser líquido (Caldo McConkey) retirando el agar de la receta
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¿Qué es el agar hierro de Kligler?
Es un medio diferencial que contiene el rojo fenol.
67
¿Qué es el agar sangre?
Es un medio diferencial que contiene indicador de pH, pero podemos distinguir a los microorganismos gracias a la reacción hemolítica que llevan a cabo. Existen microorganismo que crecen en este medio que son los alfa-hemolíticos y producen la salida de K de los glóbolos rojos sin llegar a lisarlos. Este tipo de microorganismos crecen en este medio con color verdoso, mientras que los beta-hemolíticos lisan por completo los eritrocitos
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¿Qué es el agar XLD?
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial usado para la detección y diferenciación entre Salmonella y Shigella de cultivos entéricos (enterobacterias). Ambos son patógenos gastrointestinales
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¿Qué son los medios de transporte? Ejemplos
Su objetivo es la conservación de muestras lo más inalterada posible para estudios microbiológicos sin que los microorganismos pierdan su viabilidad. Medio Stuart, Amies...
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¿Qué son los cultivos celulares? Ejemplos
Son aquellos donde se cultivan microorganismos que no se pueden cultivar en medios de cultivo sino que necesitan células. Es es caso de microorganismos intracelulares estrictos (virus, células bacterianas o humanas) como Chlamydia, Mycoplasma... A veces no basta con estos cultivos celulares, sino que hace falta el microorganismo entero.
Por ejemplo, el agente causal de la lepra (Mycobacterium leprae) se mantiene en armadillos. El agente causal de la sífilis (Treponema pallidum) se mantiene en conejos
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¿Qué es una colonia?
Es un conjunto de microorganismos (miles de millones) macroscópicamente visible sobre un medio sólido y que deriva del crecimiento de una sola célula que se ha empezado a multiplicar y que deriva del crecimiento de una sola célula que se ha empezado a multiplicar en dicho medio (aunque al origen de una colonia se le llama "unidad formadora de colonias" o UFC), dando así una descendencia en la que todas las células de dicha colonia son genética y morfológicamente idénticas
72
¿Qué diferencia hay entre un cultivo puro y mixto?
Un cultivo puro es de un solo tipo de microorganismo. Un cultivo mixto es aquel en el que hay más de un tipo de microorganismo, lo contrario de un cultivo puro
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¿Qué es la siembra por extensión?
También llamada siembra en superficie, se usa mucho y consiste en depositar sobre la placa de agar una alícuota de la muestra (una parte de la muestra), generalmente de 0,1 mL o 0,2 mL. Una vez que la tenemos sobre el agar, se extiende bien sobre la superficie con el asa de Drigalsky, una varilla fina (de cristal o metálica) con una base recta que permite la adecuada extensión de la muestra sobre la placa con movimientos rotatorios y de vaivén
Antes de llevar a cabo lo anterior, se esteriliza el asa mojándola en alcohol y se pasa posteriormente por la llama.
La muestra tiene que ser siempre líquida para poder extenderla sobre el agar sin dañarlo. Si por el contrario la muestra fuera sólida, habría que suspenderla previamente para así disolver los microorganismos que lleva. Tras ello, dejaremos dicha placa en incubación. Así, dependiendo de las condiciones de incubación, al cabo de un tiempo aparecerán colonias en esa placa.
Esta técnica nos da la posibilidad de utilizar medios enriquecidos, selectivos o diferenciales, que nos ayuden en la identificación del microorganismos en cuestión. Pero presenta un inconveniente: el asa se esteriliza mojándola en etanol, el cual posteriormente se pierde al pasarla por la llama, momento en el cual el asa se calienta un poco. Por ello, es recomendable esperar un poco para usarla o bien enfriarla antes de extender la alícuota, porque sino es posible que mate a los microorganismos debido a la elevada temperatura. Para evitar este efecto, esta siembra por extensión se puede hacer con una variante llamada perlas de cristal, pequeñas bolitas de cristal que están estériles en el autoclave y ya están frías. Realizamos la siembra al lado del mechero, le echamos unas pocas bolitas y éstas sirven para extender la muestra
Dichas bolitas, además, presentan un tamaño conocido que podremos comparar con el del microorganismo
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¿Qué es la siembra en estría?
También llamada siembra por agotamiento del asa, es la siembra más utilizada en Microbiología y es indispensable para la obtención de cultivos puros. Gracias al asa de Kolle, podremos seleccionar una única colonia que se transferirá a otra placa y se sembrará de esta manera, deslizando el asa con la muestra sobre la superficie del agar sin llegar a rasgarlo y realizando un camino lo más largo posible, siendo el objetivo de la siembra obtener colonias aisladas
Una vez que yo cojo la muestra de una única colonia y realizo la siembra y en la placa del agar me aparece un único tipo de colonia, ya puedo asegurarme de que tengo un cultivo puro. Se trata, por tanto, de una siembra rutinaria en el laboratorio para la obtención de cultivos puros. No obstante, si en una primera siembra no viéramos la pureza que buscábamos, realizamos dos o tres pases más
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¿Qué es la siembra en profundidad o por vertido en placa?
El medio de cultivo estéril se mantiene líquido a unos aproximadamente 50ºC. El agar-agar, que es el agente solidificante, tiene una propiedad muy ventajosa: no funde hasta que no alcanza los 100ºC, pero luego, conforme el medio se enfría, este lo solidifica hasta por debajo de 42ºC. Eso nos permite que a una Tª de 45-50ºC, el medio aún esté fundido pero no demasiado caliente. Lo que podemos hacer entonces es, a ese medio aún estéril, añadirle directamente la muestra. Una vez hecho esto vertemos el medio en una placa Petri vacía. Esto permite que los microorganismos de la muestra nos crezcan no en la superficie, sino en el seno del agar, lo cual resulta beneficioso para crecer aquellos microorganismos en los que el contacto con el aire/oxígeno les suponga cualquier tipo de estrés y en condiciones de humedad mayores. Así, este tipo de siembra presenta también la ventaja de que se pueden sembrar volúmenes mayores, llegando a 1 mL de muestra
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¿Qué es la técnica de enriquecimiento?
Consiste en realizar un cultivo de la muestra ambiental en medio líquidos enriquecidos y/o selectivos con el fin de aumentar la población relativa del microorganismo de interés, antes de su siembra en placa
A veces tratamos con un microorganismo en baja concentración en la muestra, por lo que necesitamos aumentar su concentración
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¿Qué es el micromanipulador?
Es una técnica en la que con ayuda un microscopio y unas pinzas especiales muy pequeñas, somos capaces de aislar células individuales y hacer con ellas lo que necesitemos. Posteriormente se podrán secuenciar
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¿Qué son las técnica de conservación y mantenimiento?
Las técnicas de conservación se refieren a largos períodos de tiempo, las de mantenimiento, a cortos períodos de tiempo. El objetivo reside en obtener microorganismos viables (capaces de crecer y multiplicarse cuando se ponen en condiciones adecuadas), puros y estables.
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¿Qué técnicas de conservación se usan?
La liofilización
Se mezclan los cultivos microbianos con leche semidesnatada o desnatada (como protector) y se somete el cultivo a desecación por sublimación, de forma que se le quita todo el agua, quedando así el cultivo deshidratado en forma de polvo que se introduce en unos viales de cristal estériles (estable durante décadas). Esta técnica solamente la usan las colecciones de cultovo.
La ultracongenlación
Consiste en mantener los cultivos a -70ºC para lo cual hay que usar agentes crioprotectores, Esto se debe a que, al congelar el cultivo líquido, el agua cuando entre en la células creará cristales que las romperán. Para evitar esto, se usan crioprotectores, que se mezclan con las células, Algunos ejemplos son el glicerol al 20% o el dimetil-sulfóxido (DMS) al 10%. El proceso sería: preparo un cultivo líquido (p.ej. 900 microL) lo coloco en un tubo de ensayo, lo mezclo con 0,2 mL de glicerol y eso permanece estable durante décadas
Algunos microorganismos requieren temperaturas menores, como los virus y algas, se congelan en N2 líquido a -196ºC
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¿Cuáles son las técnicas de mantenimiento?
Transferencias periódicas. Tenemos una placa Petri con un cultivo en el laboratorio y cada semana o dos semanas hacemos nuevas siembras en nuevas placas, para así ir manteniendo el microorganismo. El problema es que existe un riesgo de contaminación de placas, así como también de ir seleccionando variedades genéticas que no se correspondan con el microorganismo original, ya que éste, a medida que crece, sufre mutaciones. Por tanto, son válidas para una o dos siembras
El resto de técnicas no son muy adecuadas ni para mantenimiento ni para conservación, ya que podríamos perder a los microorganismos por el camino al usarlas
